증폭 사이즈

100-150 bp가 최적

최대 300 bp

Tm

90℃ 이하

너무 높으면 반응효율이 떨어짐

길이

17－25 mer

GC contents

40－60％

Tm

55－65℃
Forward primer와 reverse primer의 Tm 값을 유사하게 설계

서열

3’ 말단에 G 또는 C가 3개 이상 연속하는 서열은 피한다.

Annealing 특이성이 낮아져 primer dimer 등의 비특이적인 산물이 발생하기 쉬움

3' 말단에 T는 피한다.

(mismatch에도 annealing할 수 있음)

특이성이 낮음

상보성

Primer 내부에 3’ 말단과 일치하는 서열 (2 base 이상)을 포함하는 것은 피한다.

Primer dimer가 발생하기 쉬움

특이성

BLAST 검색을 수행하여 primer의 특이성을 확인한다.  

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Genomic DNA와의 구별

Exon junction을 포함하여 설계한다.  

Genomic DNA가 검출되지 않도록 exon junction을 가로지르는 위치로 설계한다.

mRNA에서의 위치

RT 반응에 Oligo dT Primer를 사용하는 경우, 가능한 한 mRNA의 3’ 말단에 가까운 위치로 설계한다.