TECH NOTE

Capturem™ Protein A 기술을 사용한 빠르고 효율적이며 특이적인 IP & Co-IP

• PP2A B subunit의 신속한 Protein A 컬럼 IP
• 다양한 IP buffer와의 호환성
• Capturem™ Protein A 기술을 적용하여 p53과 SV40 T의 Co-IP

■ Introduction
Immunoprecipitation (IP)은 거의 반세기동안 세포 및 분자생물학 연구의 초석이었으며 항체 기반 치료제 등 새로운 생물학적제제 개발을 위한 중요한 스크리닝 기술이었다. 학계 및 생물약제학 연구자들이 연구실에서의 발견을 치료용으로 가속화하기 위해 더 빠르고 효율적인 IP 프로토콜의 필요성이 지속적으로 제기되고 있다.

Capturem™ Protein A 컬럼은 Protein A의 항체 특이적 결합 특성을 새로운 Capturem™ 기술과 결합하여 고용량의 막 기반 친화성 정제 기법을 제공한다. 또한 항체 결합 특성의 컬럼은 IP 와 co-immunoprecipitation (Co-IP) 실험에 사용하기에도 이상적이다. 정제 변수를 최적화한 후에 Capturem™ Protein A 컬럼을 최적화된 IP 버퍼 세트와 결합하여 사용하기 쉽도록하여 완전한 IP 및 Co-IP 솔루션인 Capturem™ IP & Co-IP Kit (Code 635721)를 만들었다. 이 키트는 항체-약물 접합체를 포함하여 항체 기반 치료제의 정제 및 스크리닝에 사용할 수 있다. 또한 속도, 사용편의성, 유연성 및 수율을 포함한 레진-free 시스템의 이점은 학교를 포함한 연구기관은 물론 바이오의약개발 관련자 모두에게 강력한 도구가 될 수 있다.

■ Results

신속한 Protein A 컬럼 IP

빠르고 고품질의 항체 정제를 제공하는 Takara Capturem™ 기술은 IP 실험을 빠르고 쉽게 끝낼 수 있게 한다. 항원-항체 복합체의 10분 incubation 후, 단 5분의 hands-on time으로 효율적인 IP를 할 수 있다. 아래 실험에서 NIH3T3 lysate를 1 ㎍의 protein phosphatase type 2A (PP2A) B subunit 항체와 함께 incubation 후, equlibration한 Capturem™ Protein A 스핀 컬럼에 적용하였다. 300 ㎕의 wash 버퍼로 워싱 후 100 ㎕의 elution 버퍼로 용출한 후 다양한 fraction들을 gel 전기영동으로 분리해 polyvinylidene fluoride (PVDF) 멤브레인에 옮겨 anti-PP2A B 항체로 검출하였다. Capturem™ Protein A 스핀 컬럼은 eluate fraction에서 강한 단백질 PP2A B 신호를 보이는 좋은 결과를 보였다.

참고: 이 데이터는 최종 Capturem™ IP & Co-IP에서 발견된 것과 다른 버퍼 제형을 사용하여 생성되었다. (Methods 보기 : Immunoprecipitation performed with Capturem™ Protein A columns)


Figure 1. Capturem™ Protein A 컬럼을 사용하여 IP을 수행함. NIH3T3 cell lysates을 1 ㎍ PP2A B subunit 항체와 10분간 incubation하였다. 항체-lysate 복합체는 equlibration한 Protein A 스핀 컬럼에 적용하였으며 원심분리 및 세척단계 후에 100 ㎕의 elution 버퍼로 용출하였다. 이후 gel 전기영동으로 분리하여 PVDF 멤브레인으로 옮겨 항-PP2A B 항체로 검출하였다. eluate fraction의 단백질은 PP2A B subunit (52 kDa)에 해당한다.

다양한 IP 버퍼와의 호환성

Capturem™ Protein A 제품은 다른 키트의 IP 버퍼로 수행된 것을 포함하여 광범위한 실험 조건을 수용할 수 있는 훌륭한 flexibility를 가지고 있다. 이러한 성능을 테스트하기 위해 NIH3T3 cell lysates를 IP Kit A, IP Kit B, lysis 버퍼단독 C를 이용해 PP2A B subunit 항체를 함께 incubation하였다. Incubation 후, 항체-lysate 혼합물을 해당 IP 버퍼로 equlibration한 Capturem™ Protein A 스핀 컬럼에 로딩하였다. 원심분리 및 세척 단계 후 각 샘플에 적합한 30 ㎕ elution 버퍼로 용출하였다. (그림 2 ; Capturem Protein A 컬럼 A1, B1, C1). 용출은 항체 복합체를 완전히 회수하기 위하여 반복하였다. (그림2; Capturem Protein A 컬럼 A2, B2, C2). IP는 Capturem 컬럼에 사용된 것과 동일한 양의 lysate 와 항체로 시작해 각각의 프로토콜(그림 2; IP Kit A, IP Kit B)에 따라 수행하였다.

모든 샘플은 gel에서 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮겨서 적절한 항체를 사용하여 PP2A B subunit을 조사하였다. 아래의 gel은 IP된 샘플에서 농축된 원래 샘플 (OS)에 subunit이 있음을 보여준다. Capturem™ Protein A 컬럼으로 얻은 결과는 사용된 IP 버퍼에 관계없이 첫번째 elution에서 강한 PP2A B 단백질 신호를 보였으며 낮은 pH glycine 버퍼 (A1, C1)로 용출한 Capturem™ 샘플에서 가장 높은 수준을 보였다.

참고 : 이 데이터는 역시 최종 Capturem™ IP & Co-IP Kit와 다른 버퍼 제형을 사용하여 생성되었다.


Figure 2. 다양한 버퍼와의 Capturem™ Protein A 컬럼의 호환성

NIH3T3 cell lysates (100 ㎕, 총 단백질 130 ㎍ 포함)를 IP Kit A 또는 B와 lysis 버퍼단독 C를 이용하여 최종부피를 400 ㎕로 0.6 ㎍의 protein phosphatase type 2A B subunit 항체와 함께 incubation하였다. 항체-lysate 혼합물은 4℃에서 1시간 동안 incubation한 다음 해당 IP 버퍼로 equilibration한 Capturem™ Protein A 컬럼에 로딩하였다. 결합된 면역복합체를 적절한 elution 버퍼 30 ㎕로 두 번 용출하였다. IP는 IP Kit A 또는 B로 수행되었다. 모든 elution 샘플은 gel에서 분리하여 PVDF 멤브레인으로 옮겼으며 적절한 항체를 사용하여 PP2A B subunit이 있으며, Lane OS에는 원래 샘플에서 존재하던 PP2A B subunit이 보여진다. 용출 샘플 #1 과 #2는 IP Kit A와 B로 수행된 샘플이다. 각 lane은 IP Kit A (A1, A2), IP Kit B (B1, B2), 그리고 독립된 lysis 버퍼 (C1, C2)를 이용해 Capturem Protein에 대한 용출 샘플을 나타낸다.

Capturem™ Protein A Miniprep을 이용한 Co-IP

p53은 종양 억제제의 기능을 가지고 있고 DNA 손상 시 세포 증식 억제에 관여하는 53kDa 크기의 핵 인단백질이다. Wild-type p53은 SV40 T 항원과 같은 여러 바이러스 종양 유전자와 특정 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. p53과 SV40 T를 모두 발현하는 293T 세포를 사용하여 Capturem™ Protein A 컬럼과 함께 기본 수준에서 p53과 SV40 T를 Co-IP하는 능력을 입증하였다. Anti-SV40 T 항체를 이 세포의 lysates에 추가하였고, 혼합물은 end-over-end rotation으로 실온에서 20분동안 incubation하였다. 다음 그림2는 프로토콜에 따라 IP와 Co-IP 모두에 최적화된 Capturem™ IP & Co-IP Kit의 버퍼의 세트로 IP를 진행한 결과이다. 용출한 샘플은 gel에서 분리해 PVDF 멤브레인으로 옮겼고 p53과 SV40 T에 대한 마우스 단일 클론 항체로 blot하였다. SV40 T 의 Capturem™ Protein A IP는 eluate fraction에서 SV40 T (97 kDa)와 p53 (53 kDa) 두 밴드가 모두 존재함을 보였으며, 이 두 단백질 사이의 강한 상호작용을 확인하였다 (그림 3; E-SV40 T-1 과 E-SV40 T-2).


Figure 3. Capturem IP & Co-IP Kit을 사용하여 Co-IP를 수행함. 

P53과 SV40 T를 모두 발현하는 293T 세포를 사용하여 기본 수준에서 Co-IP 효율을 측정하였다. Co-IP를 위한 항체-단백질 복합체를 준비하기 위해 1 ㎍의 anti-SV40 항체를 293T cell lysate (100 ㎍)에 첨가하고, end-over-end rotation으로 20분간 실온에 incubation하였다. 음성 대조군으로서 lysate는 항체 없이 incubation 하였다. Capturem™ Protein A을 사용하여 IP를 2회 수행했으며 용출한 샘플은 gel에서 분리하여 PVDF 멤브레인으로 옮겨 p53과 SV40 T에 대한 마우스 단일 클론 항체로 blot을 수행하였다.

■ Conclusions

Capturem™ IP & Co-IP kit는 최적화된 IP 버퍼와 incubation 및 resin-free 워크플로우의 Capturem™ Protein A 기술을 결합하여 뛰어난 결과를 유지하면서 IP 실험을 단 5분의 hands-on time으로 간소화한다. 이러한 프로토콜의 속도는 항체-단백질 복합체를 레진 기반의 실험의 많은 절차들로 인해 발생할 수 있는 분해 및 활성 손실로부터 보호할 수 있다. 또한 이 시스템은 학술 및 제약 연구를 위한 광범위한 프로젝트에 적용할 수 있도록 flexibility를 가지고 있다.

■ Methods

Capturem™ IP & Co-IP Kit 를 이용한 IP

NIH3T3 cell lysates을 1 ㎍의 rabbit polyclonal PP2A B subunit 항체 (세포 신호)와 함께 end-over-end rotation하여 실온에서 10분동안 incubation 하였다. Captuream™ Protein A 컬럼을 400 ㎕ 의 equilibration/loading 버퍼 (1.0 M glycine, 2 M NaCl, pH 9.0)로 equilibration하고 1,000 g에서 1분간 원심분리하였다. 그런 다음 항체-lysate 복합체를 lysis 버퍼에서 400 ㎕로 희석하고 스핀 컬럼에 적용한 다음 30 g에서 4분 동안 원심분리하였다. 컬럼을 100 ㎕의 PBS에 세척하고 1,000 g에서 1분동안 원심분리 한 후 100 ㎕의 elution 버퍼(0.1 M glycine, pH 2.5), 10 ㎕의 1 M tris, pH 8.5와 함께 1,000 g에서 1분동안 원심분리하여 용출하였다. 다양한 fraction들은 gel 전기영동을 통하여 분리하였으며 PVDF 멤브레인으로 옮겨 rabbit monoclonal anti-PP2A B 항체(세포신호)로 검출하였다.

참고 : 이 실험에 사용된 버퍼는 Capturem™ IP & Co-IP kit에서 최적화된 버퍼의 초기 제형이다.

다양한 버퍼와 Capturem™ Protein A 컬럼의 호환성 검토

NIH3T3 cell lysates (100 ㎕, 총 130 ㎍ 포함)을 Active Motif (A) 또는 Thermo Fisher Scientific (b) IP 키트의 버퍼 또는 Promegalysis 버퍼 (C) 에서 0.6 ㎍의 PP2A B subunit 항체와 함께 incubation 하여 총 부피를 최대 400 ㎕까지 희석시켰다. 항체-lysate 혼합물은 4°C에서 1시간 동안 incubation한 다음 각 IP 버퍼 100 ㎕로 equilibration된 Capturem™ Protein A 컬럼에 로딩하였다. 컬럼은 1,000 g에서 1분 동안 원심분리하고 100 ㎕의 워시 버퍼로 세척한 다음 1,000 g에서 1분 동안 원심분리했다. 그런 다음 결합된 면역복합체를 1,000 g에서 원심분리하여 낮은 pH 완충액 (0.1 M glycine, pH 2.5; A and C) 또는 Thermo Fisher Scientific의 낮은 pH 용출 완충액(B) 30 ㎕로 elution하였다. 항체 복합체의 완전한 용출을 위해 용출 과정을 두 번 반복하였고 Capturem™ 컬럼에 사용된 것과 동일한 양의 lysate와 항체로 시작하여 Active Motif 및 Thermo Fisher Scientific IP 키트를 사용하여 각각의 제조업체의 프로토콜에 따라 IP를 수행하였다. 그런 다음 모든 용출 샘플을 gel에서 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮기고 적절한 항체(세포 신호)를 사용하여 PP2A B subunit을 조사하였다.

참고: 이 실험에 사용된 버퍼는 Capturem™ IP & Co-IP 키트에서 최적화된 버퍼의 초기 제형이다.

293T 세포로부터 p53, SV40 T 항원의 Co-IP

Lysates는 p53 및 SV40 T를 모두 발현하는 293T 세포로 만들었다. 1 ㎍의 anti-SV40 항체 (rabbit polyclonal, V-300, SCBT) 를 293T cell lysates (100 ㎍)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분동안 end-over-end rotation하여 incubation하였다. 음성 대조군으로서 lysate는 항체 없이 incubation하였다. 그런 다음 IP는 Capturem™ IP & Co-IP Kit를 사용하여 2회 진행하였으며, 용출한 샘플은 gel에서 분리하여 PVDF 멤브레인으로 옮겨 SV40 T (SCBT)에 대한 마우스 단일 클론 항체로 blot하고 strip 후 p53(SCBT)에 대한 검출도 진행하였다.