■ Introduction
일반적으로 Real Time RT-PCR (reverse-transcription PCR)을 위한 cDNA template을 합성하는 데 30~60분이 소요된다. PrimeScript™ Reverse Transcriptase를 이용하면 RT 반응을 15분 안에 완료할 수 있고, One step PrimeScript kit를 이용하면 역전사 과정을 5분으로 설정할 수도 있다.
PrimeScript™ Reverse Transcriptase는 속도가 빠르고 강력하여 full length cDNA 분자 (최대 12 kb)를 높은 특이성으로 정확하게 많은 수율로 합성할 수 있다. cDNA를 합성한 후에는 Probe based qPCR 또는 TB Green based qPCR 시약으로 쉽게 후속 qPCR 실험을 진행할 수 있다.

■ Result
Rapid and efficient preparation of template cDNA for real-time PCR
역전사 반응 시간을 60분 이상에서 15분으로 줄이면서 신뢰할 수 있는 높은 재현성의 Real Time PCR 결과를 생성한다.
PrimeScript™ RT Reagent Kit (Perfect Real Time) (Code RR037A)는 Real Time PCR용 cDNA를 빠르고 효율적으로 합성하는 데 최적화되어 있다.
타사의 1st strand cDNA 합성 제품과 비교하였을 때, PrimeScript™ RT Reagent Kit (Perfect Real Time) (Code RR037A)는 human total RNA에서 cDNA를 더 높은 효율로 합성하며, 상당 시간을 절약하는 이점을 제공한다 (그림 1, 표 1) 또한, 1시간 이상 소요된 타사 제품과는 다르게 단 15분만에 Real Time PCR용 cDNA 주형을 합성할 수 있었을 뿐만 아니라, 높은 수율로 cDNA를 합성하여 더 낮은 Ct값을 얻을 수 있었다 (표1).


그림 1. Human fetal total RNA에서 GAPDH와 RNAse P의 발현 분석
cDNA는 PrimeScript 또는 타사의 RTase를 사용하여 합성하였고 합성된 cDNA를 TaqMan based qPCR법으로 분석하였다. 모든 반응에서 증폭 곡선을 나타내며 성공적으로 역전사 과정 및 타겟 증폭이 진행되었음을 확인하였다. 그러나 PrimeScript를 이용한 반응에서 역전사 효율이 더 좋았고, 이는 두 타겟에 대해 더 낮은 Ct값으로 확인된다 (표1).

표 1. Real Time PCR 결과 (Ct값)

	Target	Ct	Ct Mean	Ct Std Dev
PrimeScript	GAPDH	25.24	25.23	0.02
		25.21
타사 RTase	GAPDH	26.26	26.27	0.01
		26.28
PrimeScript	RNP	30.21	30.19	0.03
		30.18
타사 RTase	RNP	31.24	31.16	0.11

Reduce reverse transcription time and pipetting
TB Green^® intercalating dye 또는 probe-based detection 중 선택할 수 있는 One-Step PrimeScript RT-PCR kit를 사용하면 모든 RT-PCR 과정을 하나의 튜브에서 수행하므로 반응 과정이 간소화되고 오염 위험 또한 최소화되어, 단 5분의 역전사 과정 후 신속한 분석이 가능하다. 그림 2에서는 One Step TB Green^® PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) (Code RR086A)을 사용하여 단일 튜브 반응 (cDNA 합성 및 qPCR이 동시에 진행됨)으로 human liver total RNA (2 pg-2 ㎍)에서 HPRT1 유전자의 발현을 분석하였다. PrimeScript RTase를 이용한 1 step 프로토콜은 다양한 RNA 농도에서 HPRT1 mRNA를 높은 감도와 특이성으로 검출하였다 (그림 2).

그림 2. Human HPRT1 유전자 검출 예 - One-step Real Time RT PCR 결과
One Step TB Green^® PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) (Code RR086A)을 이용하여 6.4 pg-100 ng의 human liver total RNA에서 HPRT1에 특이적인 프라이머로 실험을 수행하였다. Real Time PCR 후, 증폭곡선의 Ct값 (왼쪽 상단 패널)을 사용하여 표준곡선 (오른쪽 하단 패널)을 생성한 결과, 검출된 HPRT1 cDNA의 수준은 총 RNA input 양과 거의 일치하였고, 일관된 melting curve는 서로 다른 양의 템플릿을 사용하더라도 동일한 증폭 산물이 생성됨을 보여 주었다. 데이터는 광범위한 RNA 주형 농도에 걸쳐 선형 표준 곡선을 생성하였다.

From RNA to real-time data in under 45 minutes
다카라의 One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR064A)를 이용하면 시중에 판매되는 타사 one-step Real Time PCR 제품 대비해서 훨씬 더 빠르게 실험을 완료할 수 있다 (표 2). Premix 시약에는 5분 간 역전사 반응이 진행되는 PrimeScript™ Reverse Transcriptase와 PCR 증폭 시간을 줄여주는 고효율 hot start PCR 효소인 TaKaRa Ex Taq^® HS PCR 효소가 모두 포함되어 있다.

표 2. One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit 와 타사 제품의 반응시간 비교

	PrimeScript kit	A사	B사
Reverse transcription	5 분, 42°C	15 분, 48°C	10 분, 50°C
Denaturation/Activation (95°C)	10 초 (Denaturation)	10 분 (Activation)	5 분 (Activation)
PCR Denaturation (95°C) Annealing/Extension (60°C) Cycles	3 초 25 초 x40	15 초 60 초 x40	10 초 30 초 x40
Approx. total run time (min)	41	114	60

* 모든 반응은 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system 에서 진행됨.

■ Method
그림 1의 실험 예에서는 권장반응 조성 및 반응 조건에 따라 총 반응액 20 ㎕에 random hexamer를 사용하여 human fetal total RNA 1 ㎍을 역전사하였고 PrimeScript RT 반응 조건은 아래와 같다.
- 반응 조건

Component	Amount
5X PrimeScript Buffer (for Real Time)	4 ㎕
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1 ㎕
Random 6-mers (100 μM)	2 ㎕
Total RNA (1 ㎍/㎕)	1 ㎕
RNase Free dH2O	12 ㎕

- 반응조건

PrimeScript kit	Company L kit
37°C, 15 min	65°C, 5 min
85°C, 5 sec	25°C, 10 min
4°C, hold	50°C, 50 min
	85°C, 5 min
	4°C, hold
Total: approx. 15 min	Total: approx. 70 min

- 그림 1 방법
역전사 후 동일한 부피의 dH2O로 RT 반응액을 희석하여 2 ㎕를 qPCR에 사용하였다 (50 ng RNA/PCR 반응에 해당). ABI 7900HT Fast Real Time PCR System을 사용하여 GAPDH와 RNase P의 발현을 Custom TaqMan assay로 분석하였고, 모든 반응은 2회 반복 실험하였다. PCR 조건은 95°C에서 10분, 95°C에서 15초, 55°C에서 1분을 40회 반복했고, 데이터는 SDS v2.4 software automated analysis로 분석하였다.

- 그림 2 방법
그림 2의 실험 예에서는 One Step TB Green^® PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) (Code RR086A)를 사용하여 intercalator 기반의 one step Real Time PCR로 human HPRT1 유전자를 측정하였다. Human liver total RNA (6.4 pg-100 ng) 및 멸균수 (음성 대조군)를 HPRT1 프라이머와 함께 주형으로 사용하였고, 반응은 권장 프로토콜에 따라 준비하여 Dice Real Time System Thermal Cycler에서 실행하였다.

■ Conclusions
PrimeScript 역전사효소는 빠르고 강력하며 높은 특이성과 정확성 및 수율로 길이가 긴 full length cDNA 분자(최대 12kb)를 합성할 수 있다. 이를 통해 Real Time RT-PCR을 위한 cDNA 템플릿을 합성하는 데 걸리는 시간을 30~60분에서 15분 미만으로 줄일 수 있다.