Oxford Nanopore Technologies사의 NGS 플랫폼은 길이가 긴 DNA와 RNA의 염기서열을 고정밀도로 분석할 수 있는 것이 특징이다. 전용 DNA 라이브러리 제작 키트인 Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14(Oxford Nanopore Technologies)는 1~5 ng과 같은 소량의 gDNA로부터 PCR 증폭을 통해, 2 kb 이상의 long read를 제작할 수 있다. 본 실험에서는, Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14의 오리지날 프로토콜 (RPB_9191_v114_revF_11Dec2024)과 이 프로토콜의 라이브러리 제작에 PCR 효소로 PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase (Code R055A, 이하 PrimeSTAR^® LongSeq)을 사용하였다.

■ 재료 및 방법
5 ng의 인간 genomic DNA를 Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (Oxford Nanopore Technologies)에 포함된 Fragmentation Mix를 사용하여 단편화 한 후, 프로토콜에 기재된 polymerase와 PrimeSTAR^® LongSeq을 이용하여 각각 PCR 증폭하였다. PrimeSTAR^® LongSeq은 시간 단축 프로토콜과 long fragment 신장 프로토콜 두 가지를 모두 사용하였다 (그림 1).
합성된 PCR 산물에 Rapid Sequencing adapter를 ligation하여 library를 제작하고, GridION (Oxford Nanopore Technologies), R10.4.1 flow cells (Oxford Nanopore Technologies)를 이용하여 NGS 분석을 진행하였다.


그림 1. 분석 워크플로우

■ 결과
A

B

그림 2. 각 프로토콜의 매핑 비율 (%), read 길이 (N50), coverage (A), GC bias plot (B)
(A) 얻어진 시퀀스 read로부터 88만 read를 다운샘플링하여 각 프로토콜의 매핑율(%), read length (N50), coverage를 산출하였다. Long fragment 신장을 위한 프로토콜에 비해 시간 단축 프로토콜에서는 PCR 반응 시간을 단축했음에도 불구하고 같은 수준 이상의 read length (N50)를 얻을 수 있었다. 또한 Long fragment 신장을 위한 프로토콜에서는 Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 에서 제시하는 프로토콜에 비해 약 30% 긴 리드 길이(N50)를 얻을 수 있었고, 리드 길이가 증가함에 따라 커버리지도 증가하였다.
(B) 각 프로토콜에서 증폭의 균일성을 확인하기 위해 GC bias plot을 만들고 평가하였다. GC/AT 함량이 높은 영역에서 증폭효율이 높은 PrimeSTAR^® LongSeq를 이용한 결과, Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14의 프로토콜에 비해 시간 단축 및 long fragment 신장 프로토콜 모두 GC 함량에 의한 증폭 편향이 적은 결과를 나타내었다.

■ 결론
시간 단축 프로토콜
시간 단축 프로토콜에서는 PCR 반응 시간을 기존 Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 프로토콜의 약 100분에서 약 40분으로 단축하면서도 read length (N50)는 그와 동등 이상이며, GC bias는 더 작은 결과를 얻을 수 있었다.

Long fragment 신장 프로토콜
Long fragment 신장 프로토콜은 PrimeSTAR^® LongSeq의 높은 특이성으로 인해 Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14에서 제시하는 프로토콜에 비해 read length (N50)를 약 30% 늘릴 수 있고 GC bias도 낮아졌다. 이것은 분석할 수 있는 염기 서열의 양을 증가시켜 비용을 절약할 수 있다.

본 실험 결과, PCR을 이용한 long read 해석에 있어서 PCR 효소의 선택이 중요하다는 것을 시사하였다. Oxford Nanopore Technologies사의 Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (Nanopore)에는 PCR 효소가 포함되어 있지 않아 별도의 PCR 효소를 준비해야 하는데, 본 실험을 통해 PrimeSTAR^® LongSeq이 효율적인 NGS 분석을 위한 하나의 적절한 대안이 될 수 있음을 확인하였다.
PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase는 Taq DNA Polymerase보다 약 28배 높은 정확성을 가지고 있어 본 효소를 이용하는 것으로 long read sequencing을 높은 정확도와 뛰어난 증폭 및 분석효율로 진행하는 것이 가능하다.

PrimeSTAR LongSeq DNA Polymerase (Code R055A)

• 다카라의 독자 기술로 long fragment (50 kb 이상) 증폭 실현
• GC/AT rich 서열의 long fragment도 증폭 가능
• 높은 특이성: 비특이적인 증폭을 억제하고 long fragment의 multiplex PCR 적용 가능
• 반복서열에 대한 탁월한 증폭
• Long read sequencing에서 균일한 coverage 생성 가능