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FTACard 및 혈액 채혈지로 부터 직접 PCR

MightyAmp™ for Card

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제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)
비고 사용자매뉴얼
Takara
R072A
MightyAmp™ for Card
관련학술 관심상품등록 구매하기 라이선스 
200 회
(50 μl 반응 시)
250,000원  R072A_DS.v1007Da.pdf
Takara
R072B
MightyAmp™ for Card
관련학술 관심상품등록 구매하기 라이선스 
800 회
(50 μl 반응 시)
900,000원 

제품설명
MightyAmp DNA Polymerase는, 특히 2 kb 정도까지의 짧은 사슬의 증폭에 있어서 최적의 반응성을 추구하여 개발된 PCR 효소이며, 일반적인 PCR 효소에서는 증폭이 곤란한 PCR저해 물질을 많이 함유하고 있는 crude한 생체 추출액을 이용할 경우에도, 강력한 증폭 능력으로 인한 양호한 반응성을 보인다.
본 제품은 MightyAmp DNA Polymerase와 전용 버퍼를 조합하여, 혈액, 구강점막, 식물의 잎 등의 시료를 도포한 FTA 카드나 혈액을 채집한 여과지로부터, DNA 추출, 정제 등의 조작을 할 필요 없이, 직접 원하는 DNA서열을 PCR증폭할 수 있다.
통상, 시료를 도포한 FTA카드로부터 PCR증폭을 하기 위해서는 여러 과정의 DNA 정제 조작이 필요하지만, MightyAmp for Card를 이용하는 것으로, DNA정제 조작 없이 단시간에 다 검체의 해석이 가능하다.
한편, 본 효소는 98 ℃까지 polymerase활성을 억제하는 강력한 monoclonal 항체를 이용한 hot start PCR용 효소다.
※ FTA 카드는 GE Healthcare 제품입니다.
내용
200 회용*1
MightyAmp DNA Polymerase (1.25 U/㎕) 200 ㎕
2×MightyAmp Buffer for Card (Mg2 +, dNTP plus )* 2 1 ㎖ x 5
* 1 반응용량 50 ㎕의 수 * 2Mg2+ 농도는 4 mM (2× ), dNTP 농도는 800 ㎛each (2 × )
보존 -20℃
일반적인 PCR 반응액 조성 (Total 50 ㎕)
사용량 최종 농도
2 × MightyAmp Buffer for Card 25 ㎕ 1 ×
Primer 1 15 pmol 0.3 ㎛
Primer 2 15 pmol 0.3 ㎛
시료를 도포한 FTA Card / 여과지* 1 직경 1.2 ~ 2 mm
MightyAmp DNA Polymerase 1 ㎕ 1.25 U/50 ㎕
dH2O up to 50 ㎕
* 1 시료 예 - EDTA 처리 혈액, Heparin 처리 혈액을 도포한 FTA Gene card, FAT Micro Card 또는 여과지
- p식물잎을 파쇄하여 도포한 FTA Plant Saver Card
- 구강 세포를 도포한 FTA Micro Card
- 식물잎을 직접 도포한 FTA Plant ard
* 2 구연산 혈액을 사용하면 반응이 크게 저하되므로 구연산 혈액을 이용한 샘플의 사용은 권장하지 않는다
Primer 디자인에 관하여
가능한 OLIGO Primer Analysis Software ( Molecular Biology Insights 사) 등 primer 디자인 소프트웨어를 이용 하여 최적의 배열을 선택합니다.
Tm 값 (아래 식*기준)이 60 ℃ 이상이 되도록 설계할 것을 권장한다.
  * Tm 값 ( ℃) = [ (nA + nT ) × 2 + ( nC + nG ) × 4] -5

MightyAmp DNA Polymerase의 경우 inosine 을 함유하고 있는 primer의 사용은 피한다
PCR 조건
신장(extension) 온도를 68℃로 설정한 3 step PCR 표준 조건이다.

[3 step PCR ]
98 ℃ 2 min. * 1
98 ℃ 10 sec.
60 ℃ 15 sec. │ 30~40 cycles
68 ℃* 2 1 min. / kb
또는
98 ℃ 2 min. * 1
98 ℃ 10 sec. ]30~40 cycles
68 ℃ 1 min. / kb
* 1 강력한 hot start 항체를 사용하고 있기 때문에 반드시 98 ℃, 2 분 초기 변성을 실시하여 항체를 열 변성 시킨다.
* 2 3 step PCR 의 경우 신장 온도를 68 ℃로 설정 한다.
전기영동
MightyAmp DNA Polymerase를 이용하여 증폭한 PCR 산물을 전기 영동 할 경우 TAE Buffer의 사용을 권장한다. TBE Buffer를 사용하면 이동 패턴이 다소 퍼지는 현상이 발생하여 깨끗한 영동 결과를 얻지 못할 수 있다.
PCR 산물에 대해
MightyAmp for FFPE를 사용하여 증폭한 PCR 산물의 대부분은 3' 말단에 A가 1 염기 추가되어 있다. 따라서 PCR 산물을 그대로 T - Vector ( pMD20 : TaKaRa code 3270, pMD19 (Simple ) TaKaRa Code 3271 )에 클로닝 할 수 있다.
문제해결
현상 문제점 대책
증폭되지 않거나
증폭 효율이 좋지 않다.
primer의 Tm 값 위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인한다
2 step PCR 3 step PCR 을 시도해 본다.
3 step PCR 2 step PCR 을 시도해 본다
(3 step PCR 증폭 하지 않는 경우 2 step 으로 증폭하는 경우가 있습니다 )
Annealing 2 ℃ 씩 내려 본다
Cycle 수 사이클 수를 최대 40cycles 까지 증가 시켜 본다
시료 크기 직경 2 mm 로 증폭 되지 않는 경우 → 직경 1.2 mm 하기
직경 1.2 mm로 증폭 되지 않는 경우 → 직경 2 mm 하기
비 특이적 증폭이
현저하다.
primer의 Tm 값 위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인 한다.
3 step PCR 2 step PCR 을 시도해 본다
Cycle 수 25 ~ 30 cycles 설정

Keyword :
-
PCR Enzyme (TaKaRa)
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