*Capturem Extracellular Vesicle Isolation Kit 제품은 2022년 8월 종매되었습니다.
EV 연구의 기술적 한계 극복
세포에서 분비되는 Extracellular vesicles (EV)는 크기, 운반체, membrane composition, biogenesis 면에서 매우 다양한 성질을 가지고 있고, 생물학적 기능면에서는 biomarker 발견과 분자 진단을 위하여
중요한 역할을 하고 있다. EV는 대부분의 세포에서 분비되며, 대부분의 체액에서 존재하면서 국소세포와 거리가 먼 세포의 소통에 관여하여, 정상 상태와 질병 상태 모두에서 중요한 역할을 한다.
하지만, EV가 어떤 기전을 통해 생체 물질을 선택하여 운반하고, 세포 외로 방출했을 때 목적 세포에서 이를 어떻게 전달하는 것인지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다. 연구자들은 EV를 진단 및
치료에 활용하고자, 형태학, 단백질학, 유전학, 전사체학 분석을 통해 EV 작용 기전을 연구하고 있다.
Alpha Nano Tech와 같은 회사들은 연구자들에게 전문 지식과 완벽한 EV 특성 분석 서비스를 제공함으로써 EV 연구를 지원하고 있다. 다카라바이오는 Alpha Nano Tech의 연구 책임자
(chief scientific officer, CSO)인 Daria Filonov 박사를 통해 EV 연구와 그 기술적 한계를 극복하는 방법을 인터뷰했다.
Q. Alpha Nano Tech는 어떤 회사이며, 담당하는 일은 무엇인가요?
Alpha Nano Tech는 생체 내 모든 체액이나 조직으로부터 EV를 분리하는 것부터 연구를 설계하고 실행하는 것에 도움을 주는 회사입니다. 최근 Exosome을 비롯한 EV에 대한 관심도가 증가하면서,
이에 대한 특성 분석이 굉장히 중요해졌습니다. 이 특성 분석을 위해, 샘플의 순도와 EV의 크기, 농도, 균질성, 전하, biomarker 발현, 단백질과 RNA 전사체 분석을 진행함과 동시에 전자현미경을 통해
구조적 분석과 교차 검증을 수행합니다.
Q. EV가 왜 중요하다고 생각하나요?
EV는 크기나 생산된 세포에 따라서 분류할 수 있고, dual-layer 형태의 막을 가지고, 생산된 세포에 특이적인 단백질이나 RNA, DNA를 운반합니다. 근래에 EV에 대한 관심도가 높아지고 있지만, 사실 EV가 얼마나 많은 역할을 하는지, 잠재적으로 얼만큼 활용될 수 있는지를 이해하기 시작한 건 얼마 되지 않았습니다. EV에 대한 연구는 약물 내성, 신생 혈관 형성, 생식과 관련한 항염증제, 조직 재생 및 치료제와 같이 다양한 질환에서의 조직 특이적 진단을 위해 연구되고 있지만, 이는 exosome이 활용될 수 있는 수 많은 예 중 하나일 뿐입니다.
Chief scientific officer (CSO),
Daria Filonov, PhD,
at Alpha Nano Tech
Q. Alpha Nano Tech의 목표는 무엇이며, exosome 연구를 위해 어떤 일을 하나요?
우리 회사는 나노물질과 exosome에 대한 과학적, 기술적 전문 지식을 제공하는 것을 목표로 하고 있습니다. 선도 기업과의 교류를 통해 고객에게 가장 최신식의 기술과 제품을 제공하고자 하며,
생산되는 기기나 상용 제품에 대한 품질 관리 서비스를 제공합니다.
Q. Exosome 특성 분석 과정에서 가장 중요한 exosome 분리는 어떻게 진행하고 있나요?
Exosome 분리는 실험 초기 과정으로, 실제로 가장 중요한 단계입니다. 우리는 시판되고 있는 대부분의 제품과 기술을 이용해 보았으며, 이 과정에서 각 방법이 어떻게 exosome을 분리하는지,
초기 사용 샘플의 종류에 따라 어떤 결과가 초래되는 지 확인하였습니다. 또한, 서비스를 제공하면서, 유사한 샘플에서 동일한 방법을 이용하여 EV를 추출함으로써, 서로 다른 연구실 간의 차이를 줄일 수 있는 것을
확인하였습니다.
제 생각에는 가용성이나 시간 소모, 효율성, 특이성, 추출된 EV의 손상 유무를 기준으로 EV 분리법을 선택해야 한다고 생각합니다. 예를 들어, 사용이 쉬워 많이 사용되는 방법인 PEG (polyethylene glycol) precipitation kit는
EV 표면의 polymer와 결합함으로써 충분한 양의 EV를 얻을 수 있으나, 종종 EV의 크기나 표면의 특성을 변화시킬 수 있습니다. 이 방법은 비용, 실험 과정, 시간 소모에서는 효율적이나, 정제된 EV에 물리적으로
영향을 미쳐 특이성이 감소할 수 있습니다.
많이 사용되는 또 다른 방법은 초원심분리을 이용한 것으로, 고수율의 EV를 얻을 수 있으나, 모든 연구실마다 특정 기기를 보유하는 것이 어려울 뿐 더러 시간이 많이 소요되고 획득하는 EV의 순도가 좋지 않습니다.
이 방법은 세포 배양액과 같이, 혈청이나 다른 단백질을 포함하지 않는 상대적으로 깨끗한 샘플에서 EV를 잘 분리할 수 있습니다. 혈장과 같이 다양한 성분이 포함되어 있는 샘플에서 초원심분리를 이용하면,
분리 후에도 exosome과 유사한 크기의 단백질이나 지질단백질을 포함하게 됩니다.
일반적으로 EV 분리하기 위한 대부분의 방법들은 유사 단백질이 함께 혼입됨으로써, 후속 분석에 간섭할 수 있다는 문제가 있습니다. 예를 들어, 혈장 유래의 exosome을 이용해 단백질체 분석을 진행하였을 때,
샘플 내 포함되어 있는 알부민이나 IgG와 같은 단백질로 인해 exosome에 특이적인 소수의 단백질을 검출하기 어려울 수 있습니다.
또 다른 문제는 뇌척수액과 같이 샘플 양이 적은 체액에서는 분리되는 EV의 수율이 낮다는 점입니다. 우리는 이런 문제를 어떻게 해결하는지 아시나요? 먼저, 체액의 성질, 원리, EV 분리양을 고려하여 EV 분리에
가장 효과적인 방법을 선택합니다. 특정한 프로젝트를 성공적으로 이끌기 위해, 우리는 종종 Size exclusion, ultrafiltration, 친화성을 이용한 정제 과정 등을 실험 과정에 추가하여 최적화 하며, 이는 한 방법이
모든 실험에서 완벽하게 적용되는 것은 어렵기 때문입니다.
우리는 혈장, 소변, 타액, 세포 배양액을 포함하는 몇몇 샘플에서 EV를 추출할 때, 다카라바이오의
Capturem™ column을 통해 좋은 결과를 얻었습니다. 샘플을 먼저 정제하고, Exosome과 결합하는 column에 넣은 후, wash, elute하는 4단계의 과정으로 진행하게 됩니다. 이 때, Elution을 추가로 진행하여
더 많은 양의 EV를 얻거나, 필요하다면 elution 용액 양을 조절함으로써 고농도의 샘플을 얻을 수 있어, fNTA, western blot 혹은 TEM으로 분석하기 위한 충분한 양과 농도로 최적화할 수 있다는 것이
아주 편리했습니다. 이 방법은 보통 30분 내에 완료되며, 특별한 장비나 fraction collection 과정이 불필요합니다. 처음 단계로 Preclearing을 진행하게 되는데, 이는 EV가 아닌 단백질의 오염을 최소화할 수 있습니다.
다음 단계에서는 Column에 샘플을 넣어주는데 exosome은 membrane에 결합하고 그 외의 수용성 단백질과 같은 분자들은 제거하게 됩니다. 이 때 한 가지 고려해야 할 점은 정제 용량이 정해져 있어,
만약 샘플 양이 너무 많거나, 농도가 너무 높을 때에는 EV 분리 수율이 낮아질 수 있다는 점입니다.
Q 앞으로의 EV 연구는 어떻게 발전될 것이라고 생각하세요?
EV의 기원과 역할에 대한 이해가 깊어질수록 기술과 치료법의 혁신을 더 빨리 기대할 수 있을 것이라 생각합니다. 우리는 exosome이 재생 및 개인화 된 의학 분야에 혁명을 일으키기를 기대하고 있습니다.
[원문] Overcoming technical challenges in extracellular vesicle research
