닫기
TaKaRa
로그인  |   회원가입  |   ID/PW 찾기   |  제품상담문의  
제품명/제품코드
키워드검색
검색
닫기
  • 고객지원센터 
  • 업무안내│학술지원
  • 전화번호│02-2081-2510
  • Email     │support@takara.co.kr
  • 대전지사 
  • 업무안내│대전/충청지역 주문, 학술지원
  • 전화번호│042-828-6525
  • Email     │tkbd@takara.co.kr
  • 업무시간안내
  • [ 평  일 ] 09 : 00 ~ 18 : 00 │ [ 점심시간 ] 12 : 00 ~ 13 : 00
  • 토·일요일, 공휴일은 휴무입니다.
Home > 전제품보기 > 제한효소 · Quickcut > 제한효소 > 제한효소의 사용에 관하여

제한효소의 사용에 관하여

-
현재까지 발견된 제한효소는 반응에 필수적인 인자와 절단부위의 특성 등에 따라 다음의 3가지 형으로 구분한다.
대분류 반응필수인자 절단부위 효소 예
I 형 ATP, S-adenosyl methionine, Mg2+ 인식부위와 절단부위가 다르고 절단부위도 일정치 않음 EcoB, EcoK
II 형 Mg2+ 인식부위내 또는 그 근방의 특정부위를 절단 EcoR I, BamH I
III 형 ATP, Mg2+ 인식부위와 절단부위는 다르나 특정부위를 절단 EcoP I, Hinf III
이 중 유전자공학 실험에 이용하고 있는 것은 일반적으로 II형 효소로서, 현재시판되고 있는 효소는 전부 II형에 속한다. 제한효소는 반응조건, 기질 DNA의종류에 따라 절단상황, Star 활성의 출현빈도 등의 차이가 관찰되며, 그 정도도효소에 따라 다르다. 따라서 제한효소를 사용할 때는, 이같은 요인에 충분히 주의하여, 사용목적에 맞게 정확하게 절단할 수 있도록 하여야 한다. 다음은 제한효소 사용에 있어서 주의할 점을 소개한다.
1) 메틸화의 영향
DNA methylase 유전자를 갖고 있는 숙주균으로부터 조제한 DNA는 염기의 일부가 메틸화 되어 있어, 해당서열을 인식 절단하는 제한효소를 사용하여도 거의절단되지 않는다. 메틸화 되는 부위는 기질 DNA의 종류, 숙주의 종류에 따라 다르다. 예를 들면 대장균의 경우에는 숙주의 종류에 따라 methylase의
그림 1 PCR법에 의한 DNA 증폭 과정
영향을 받는다. 통상 형질전환에 자주 이용하는 균주 - C600, HB101, JM109등은 dam, dcm을 모두 가지고 있으므로 이들 균주로부터 조제한 DNA를 사용할 때는 주의가 필요하다.
또 동물 유래의 DNA의 경우, CG서열은 5mCG로 되어 있는 경우가 많고, 식물유래의 DNA의 경우는 CG 또는 CNG서열이 5mCG 또는 5mCNG로 되어 있는 경우가 많다.
보다 자세한 내용은 [제한효소 활성에 대한 메틸화의 영향]의 표 (F-12 페이지)를 참조하기 바람.
2) Star 활성
제한효소 중에는 기질이 되는 DNA에 대하여, 특정한 반응조건하에서 사용하면특이성이 저하되어 본래의 인식서열과 다른 염기서열을 절단하는 것이 있다. 이같은 현상을 제한효소의 Star 활성이라고 한다. Star 활성의 출현빈도는 효소,기질 DNA, 반응조건 등에 따라 다르나, 거의 모든 제한효소가 Star 활성을 갖고있다고 해도 과언이 아니며, 인식서열 특이성의 저하 외에 DNA에 부분적으로nick이 생기는 Nick 활성이 관찰되기도 한다.
Star 활성을 최대한 억제하기 위해서는 반응성이 저하되더라도 일반적으로낮은 글리세린 농도, 중성 pH, 높은 염농도 조건에서 반응하는 것이 좋다.
보다 자세한 것은 [제한효소의 Star 활성]의 표(F-16 페이지)를 참조하기 바람.
3) 부분분해
기질 DNA에 대해 절단이 예상되는 제한효소를 사용하여도 충분히 절단되지 않는 경우, 상기의 1), 2)와 효소의 실활 외에 DNA의 순도, 반응 저해물질의 영향, 기질 DNA의 종류 등이 관여할 때도 있다. 특히 DNA의 종류에 따라 사이즈와 인식부위가 다르면, 완전 분해에 필요한 효소량도 변하고, 그 값으로부터 계산되는
[1 ㎍ DNA의 완전분해에 필요한 제한효소의 추정량]과 [실제량]이 각각의 효소에 따라 차이가 생긴다. 이런 차이는 효소와 인식서열 주변의 고차구조와의상대적인 성질에 따른 것으로 생각되며, 실제로 pBR322 DNA에는 제한효소 Nae I으로 절단되지 않는 부위가 있다 (Site preference). 또 반응액조성(spermidine의 첨가)에 의해 절단되는 순서가 바뀌는 경우도 있다.
“DNA and spermidine provide a switch mechanism to regulate the activity of restriction enzyme Nae I”, Conrad, M. and Topal, M. D. (1989) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 9707-9711.

4) DNA 결합단백질
제한효소로 반응한 후 전기영동하였을 때 밴드가 확인되지 않거나, 밴드의 퍼짐현상이 일어나거나, 밴드의 이동도가 이상할 경우 등의 문제가 발생할 때가 있다. 이는 효소 단백질 자신이나 다른 단백질이 DNA에 결합하고 있기 때문에DNA가 gel 속으로 들어가지 않거나, DNA가 ethidium bromide에 염색되지 않기 때문이다. 이같은 현상이 관찰될 때는 SDS 등의 변성제를 최종농도 0.1%가 되도록 시료에 첨가하여 전기영동하면 개선되는 경우도 있다.
5) 기타
제한효소의 안정기간은 기본적으로 품질검정 후 약 1년간으로 정하고 있으나 거의 모든 효소가 그 기간이 경과해도 급격히 실활하지 않는다. 따라서 구입후 장기간 보관한 효소도 충분히 사용할 수 있고, 이들 효소에 대해서는 사용 전에 역가검정을 실시한 후 사용하는 것이 좋다. 또 보존중에 효소가 동결되었을 때도 거의 모든 효소가 급격히 실활되지는 않으므로 위의 경우와 같이 사용 전에역가검정을 실시한 후 사용하는 것이 좋다.
Q&A
Q-1 제한효소에는 각각의 Universal 버퍼에서의 상대활성을 표시하고 있으나,첨부 버퍼보다 다른 버퍼가 높은 활성을 나타내는 경우가 있다 (예를 들면 Hind III의 첨부 버퍼는 M이지만, K 버퍼가 200%의 활성을 나타낸다). 이런 경우, 활성이 높은 버퍼를 사용해도 문제가 일어나지 않는가?
A-1 문제 없습니다. 첨부 버퍼는 활성 측정에 사용한 것으로 Basal 버퍼에 가까운 조성 등을 갖는 것을 선택하였으므로 반드시 가장 활성이 높은 버퍼라고는 말할 수 없습니다. 따라서 첨부된 것 이외의 버퍼를 사용하여도 좋으나 숫자에 ( )가 된 것은 Star 활성 등의 영향을 받기 쉬우므로 사용하지 않는 것이 좋습니다.

Q-2 TaKaRa 제한효소 중에는 Basal 버퍼에 비하여 상대활성이 낮은 Universal버퍼를 첨부하고 있는 효소가 있는데 이유는?
A-2 TaKaRa의 제한효소는 double digestion을 전제로 가능한한 Universal 버퍼를 첨부하고 있습니다. L, M, H 버퍼는 주로 염농도가 다르므로 우선 낮은 염농도에서 한개의 효소를 절단하고 다음에 염을 첨가하여 높은 염농도에서 두번째 효소로 절단하면 ethanol 침전 등으로 버퍼를 교환할 필요가 없습니다. 5종류의 Universal 버퍼에서 상대활성이 그다지 높지 않은효소에는 Basal 버퍼를 첨부하고 있습니다. 이 Basal 버퍼는 각 제한효소의 최적 버퍼로 조성이 제한효소마다 다르므로 주의하시기 바랍니다.
활성의 정의
제한효소 활성 1 U는, 각 효소 반응액 50 ㎕ 중 원칙적으로 37℃에서 1시간에1 ㎍의 λDNA를 완전 분해하는 양으로 한다. 또 효소활성 측정에 사용한 기질과 반응온도는 각 효소마다 기재되어 있다. 한편 다른 Universal 버퍼에서의 상대활성은 F-6 페이지에 종합하여 정리하여 놓았다. 상대활성표에는 활성측정버퍼와 사용권장 버퍼를 표시하여 놓았으므로 복수의 효소에 의한절단 등의 반응에 유용하게 이용할 수 있다.
순도검정
각 효소에 대하여 제조 lot 별로 아래의 항목을 기본적으로 검사하고 있다.

1. Overdigestion web
각 정제효소에 대하여 기질 DNA(통상 λDNA) 1 ㎍과 과량의 효소를 24시간 반응시킨 후, 아가로스 겔 전기영동 패턴에 의해 비특이적인 DNase의 유무를 판정한다.

2. Genome DNA Analysis
선정한 제한효소(효소마다 표기)에 관하여 검사한다. 적당한 박테리아 게놈DNA (agarose embedded, 0.5 ㎍ DNA/ 50 ㎕ gel)에 20~150 U의 제한효소를첨가해 24시간 반응한 후, pulsed-field 전기영동을 실시하여 DNA 전기영동 패턴의 변화 유무를 확인한다. 개요에 관하여는 F-9 페이지에 종합하여 정리해 놓았다.

3. 라이게이션-Recutting web
기질 DNA에 대하여 우선 2~50배의 효소로 반응시킨 후 절단된 DNA를 회수하여 5’말단 농도가 0.1~1.0 μM이 되게 T4 DNA ligase 버퍼[66 mM Tris-HCl(pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM ATP]에 용해한다. 적당량의 T4DNA Ligase를 첨가하여 16℃, 1시간 또는 16~18시간 반응한다. DNA를 회수하여 제한효소 반응액에 용해한 후, 동일 제한효소로 재절단한다. 이상의 결과에 따라 ligase inhibitor, phosphatase, exonuclease의 유무를 판정하고 있다.한편 라이게이션 효율, 라이게이션 효율에 관한 TaKaRa의 품질규격에 대해서는 F-10 페이지에 종합적으로 정리하였다.

4. pKF3 Cloning web
Enforcement cloning vector pKF3 DNA의 multi-cloning site에 1개의 제한효소절단부위를 갖는 제한효소에 대하여 체크하고 있다. pKF3 DNA에 대하여 10배 과량의 제한효소로 반응시키고, 실활처리한 다음 절단된 DNA를 DNA 라이게이션 Kit Ver.1 (TaKaRa Code 6021)를 사용해 16℃, 30분간 반응한다. 이 반응액 일부를 TH2 competent cell에 형질전환하여 2종류(LB-Cm-Sm, LB-Cm)의 플레이트 위에서 37℃에서 2일간 배양한다. LB-Cm-Smplate 위에 출현하는 콜로니의 유무에 따라 극히 미량의 exonuclease의 유무를판정한다.
그 개요에 관하여는 F-11 페이지에 종합하여 기재하였다.
보존온도 · 보존형상
각 제한효소는 모두 -20℃ 에서 보존한다(단, Fse I, Aat II는 -80℃ 동결보존). 효소 모두 한번 정도의 동결융해는 효소활성에 영향을 미치지 않는다. 보존형상에관하여는 F-28 페이지에 그 보존 완충액과 조성을 종합 기재하였다.
첨부 버퍼에 관하여
TaKaRa에서는 제한효소 활성측정에 이용하는 10x 버퍼와 10xLoading 버퍼를 첨부하고 있다.