자동화된 단일 셀 RNA-seq 플랫폼에는 무엇이 있는가?
임상 및 응용분야에 있어서 transcriptome 분석을 위한 NGS(Next-Generation Sequencing, 차세대염기서열분석)의 사용은 다수의 단일 세포에 대한 정확하고 병행적인 처리가 필요하다. 이러한 요구를 충족시키기 위해 여러 플랫폼이 출시되었지만, microfluidics, droplet encapsulation 또는 multi-sample nanodispensing 등과 같은 기반 기술의 변화는 단일 세포가 캡처되고 처리되는 방법에 영향을 미친다. 이러한 platform간의 차이점은 무엇이며, 이러한 차이점이 데이터에 어떤 영향을 줄까?
직접적인 성능 비교는 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq) 실험을 위해 신뢰할 시스템을 결정하는 데 도움이 될 수 있다. ABRF(Association of Biomolecular Resource Facilities) GRG(Genomics Research Group)는 Fluidigm, 10X Genomics, Illumina/Bio-Rad, Takara Bio의 platform을 평가하는 종합적인 연구를 실시했다. 그들은 ABRF 2018 conference에서 "Comparative analysis of single-cell RNA sequencing platforms and methods(파일 링크)"이라는 제목의 포스터를 통해 심층적인 결과를 발표했다.
scRNA-seq platform 비교
저자들은 주목할 만한 단일 세포 NGS library prep 시스템 간의 기술과 데이터 품질 비교에 착수하였다 : Fluidigm社 C1(96 IFC 및 HT-IFC), 10X Genomics社 Chromium Controller, Illumina/Bio-Rad社 ddSEQ,
Takara Bio社 SMARTer ICELL8 single cell system.
ABRF GRG는 histone deacetylase inhibitor인 TSA 또는 DMSO로 처리된 수백 개의 개별 SUM149PT 세포(breast cancer cell line)로부터 데이터를 생성했다. 각 platform의 기술을 이용해 단일 세포를 캡처하고
library를 준비했다. Bulk RNA-seq는 각 처리 조건의 세포의 일부로 수행되었다.
The findings
Nano-dispensing를 활용하는 유일한 시스템인 Takara Bio SMARTer ICELL8 시스템은 일반적인 microfluidics 시스템에서의 세포 크기에 따른 제약이나 droplet 기반 시스템의 imaging이 불가능한 제약 없이,
heterogeneous population에서 수백 개의 단일 세포를 높은 처리량으로 진행하여, 샘플 처리의 오류를 줄일 수 있다.
SMARTer ICELL8 시스템은 ordered array를 사용하는 유일한 시스템으로서 두각을 나타냈다. ABRF GRG는 최대 1,800개의 단일세포의 캡처 용량을 가진 이 시스템이 세포를 monitoring하고,
세포 크기의 제약을 받지 않으며, 세포 캡처 효율이 우수하고, 3' expression(DE) profiling을 사용한다는 점에 주목했다. (업데이트: Takara Bio는 이후 Full-Length scRNA-seq에 대한 workflow를 개발했다.)
SMARTer ICELL8 시스템은 총 세포 캡처 및 library 제작 시간이 다른 platform에 비해 상당히 낮았다. SMARTer ICELL8 시스템의 경우 7시간, Fluidigm C1 HT의 경우 12시간 그리고 Fluidigm 96 IFC,
10X Chromium 및 Illumina/Bio-Rad ddSEQ의 경우 각각 10시간이다. 또한 SMARTer ICELL8 시스템은 sensitivity, read efficiency 및 gene diversity라는 중요한 데이터 품질 지표에서 뛰어났다.
Sensitivity
민감도, 즉 구별되는 유전자를 검출하는 능력에 관해서라면, SMARTer ICELL8 시스템은 10X Chromium의 최고 데이터보다 훨씬 더 우수한 성능을 발휘한다(아래 그림 1). SMARTer ICELL8 시스템에서 10배 정도의
유전자가 검출되었다. 전체적으로 SMARTer ICELL8 시스템이 검출한 유전자의 중간값은 두 가지 조건에서 모두 10X genomics 및 Illumina/Bio-Rad ddSEQ의 유전자 수를 능가했다.
그림 1. Takara Bio SMARTer ICELL8 Single Cell 시스템을 이용한 scRNA-seq의 우수한 성공률(Gene detection). 10X Genomics Chromium 시스템에서 테스트한 두 가지 조건은 즉시 처리한
10X fresh(pink)와 overnight shipment후 처리한 10X shipped(purple)이었다. Takara Bio의 플랫폼(teal)은 10X Genomics Platform보다 월등히 우수한 성능을 보였다.
Read efficiency
이어지는 분석(아래 그림 2)에서 저자들은 threshold(CPM>1)를 통과하는 고품질의 사용 가능 데이터 획득 효율성 또는 Read efficiency를 살펴보기를 원했다. 모든 읽기가 유용한 데이터로 전환되는 것은
아니지만, 이 threshold를 통과하는 read는 확인된 세포의 유전자를 계산하는 데 사용될 수 있다. 시퀀스된 총 read수 중에서 사용 가능한 read 비율이 높을 경우 효율성이 더 높다. 특히 10X genomics와
Illumina-Bio Rad platform의 데이터는 낮은 효율을 보였다. 즉시 처리한 10X Genomics 시스템의 경우, 5.3 x 10
8의 총 read중 ~1.4 x 10
8의 유용한 read(약 26%, overnight shipment 후 처리 시 ~36%)를
산출했다. 한편, SMARTer ICELL8 시스템의 경우, 총 read 수 ~2.1 x 10
8중 0.9 x 10
8의 유용한 read(약 43%)가 산출했다.
그림 2. Takara Bio SMARTer ICELL8 Single Cell 시스템을 사용한 scRNA-seq에 대한 높은 Read(데이터) efficiency.
총 Read수에 대한 고품질 Read의 비율이 Read efficiency를 나타낸다. SMARTer ICELL8 시스템은 43%의 사용 가능한 Read 성능을 가지고 있었으며, 10X는 즉시 처리하는 조건의 경우 26%로 부족했다.
Gene diversity
다수의 다른 유전자를 정확하게 분석하는 것은 단일 세포 연구의 성공에 매우 중요하다. Platform별 기술에 따라 이뤄진 gene diversity를 평가하기 위해(아래 그림 3), 저자들은 세포당 20,000개의
Read(Fluidigm C1의 경우 세포당 1,000,000개, 그 외 모든 platform의 경우 세포당 100,000개)로 down-sampling 하였다. SMARTer ICELL8 시스템이 유사한 성능을 나타내는 반면, 10X Genomics는
그에 뒤처져 SMARTer ICELL8 시스템이 10X Genomics Chromium보다 훨씬 더 복잡한 Gene diversity을 결정할 수 있음을 나타냈다.
그림 3. Takara Bio SMARTer ICELL8 Single Cell 시스템에서의 매우 복잡한 scRNA-seq 데이터. platform 전반의 데이터를 세포당 20,000개로 down-sampling했을 때, 검출된 유전자에서
10X Genomics(핑크와 보라)가 다카라 바이오(청록색)에 크게 뒤졌다.
Conclusions
자동화된 scRNA-seq platform 내부에는 어떤 것이 있는가? 평가된 시스템들은 여러 가지 특징에 따라 다르지만, Data quality, Efficiency 및 Diversity와 같은 요소를 자세히 살펴보면 SMARTer ICELL8 시스템이
빛을 발한다. 3' DE 및 scTCR profiling과 같은 시스템 및 사용 가능한 application에 대한 자세한 내용은 SMARTer ICELL8 학습 센터를 참조하십시오.
Acknowledgments
Takara Bio는 이 연구를 수행하고, 연구의 결과를 ABRF 2018 Conference에서 발표하며, 우리가 이 기사에서 그들의 결과를 공유할 수 있도록 하기 위해 ABRF GRG(특히 Dr. Sridar V. Chittur, Director of the Microarray
& HT Sequencing Core in the Center for Functional Genomics at University of Albany)에게 감사를 드립니다. 또한 그들이 연구의 일부로 Takara Bio의 SMARTer ICELL8 Single Cell system을 선택하게 된 것을 영광으로 생각한다.
