Plasma cfDNA의 양적, 질적 분석

Data kindly provided by: Laboratory of sports medicine, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

◆ Introduction
Cell-free DNA (cfDNA)는 태아의 유전자 진단 또는 종양 유래의 DNA를 모니터링하기 위한 시료로써 사용되고 있지만, cfDNA 자체의 질적ㆍ양적 변화를 포괄적으로 분석한 자료는 많지 않다. 본 연구실에서는 정상인의 Plasma cfDNA (혈장 cfDNA)가 특정 실험 처치 전ㆍ후에 질적ㆍ양적으로 어떻게 변화하는지 NGS를 통해 포괄적으로 분석하고자 하였다.


Laboratory of sports medicine, Faculty of Medicine, University of Tsukuba
연구실 홈페이지: http://tsukuba-laboratorymedicine.com/

◆ 사용제품
ThruPLEX^® DNA-Seq Kit (Code 400674)

◆ Workflow
① 실험 처치 전ㆍ후의 정상인 혈액을 EDTA Tube에 채혈하여 원심분리로 혈장 (Plasma) 분리
② 2 ㎖의 혈장에서 NucleoSnap DNA Plasma (Macherey Nagel)을 이용하여 cfDNA 추출
③ ThruPLEX^® DNA-Seq Kit을 이용하여 10 ng ~ 30 ng의 cfDNA로부터 NGS Library 제작
④ Agilent Bioanalyzer를 이용하여 NGS Library의 농도 측정
⑤ Illumina^® NextSeq500을 이용하여 시퀀싱
⑥ Bowtie 소프트웨어를 이용하여 mapping

◆ ThruPLEX^® DNA-Seq Kit을 이용한 cfDNA NGS Library 제작 결과
ThruPLEX^® DNA-Seq Kit을 이용하여 실험 처치 전ㆍ후의 10 ng ~ 30 ng의 cfDNA로부터 Illumina^® NGS Library를 제작하고, Agilent Bioanalyzer로 NGS Library의 크기와 농도를 확인하였다. 처치 전 샘플과 후 샘플에서 모두 300 bp 부근의 밴드가 검출된 것으로 보아 Illumina^® NGS Library가 적절히 제작되었음을 확인할 수 있었다 (NGS Library 제작 전 cfDNA의 사이즈: 약 160 bp, ThruPLEX adapter 사이즈: 약 140 bp)


◆ NGS Mapping 결과
실험 처치 전과 비교하여 처치 후의 cfDNA에서 게놈 상의 특정 위치에 많은 수의 read가 매핑되었으며, 특히약 250배의 count reads 차이가 있는 위치를 식별할 수 있었다. 이는 혈장 cfDNA가 생체에 가해지는 특정 스트레스에 의해 질적ㆍ양적 변화를 일으킬 수 있음을 나타낸다.


◆ 향후 계획
본 제품을 이용하여 인간이나 동물에 대해 다양한 조건 하에서 cfDNA의 염기서열, 특성 및 메커니즘을 추가로 분석하고자 한다.