◆ Introduction
항체 표식(Antibody labeling)은 연구 분야를 확장할 수 있는 방법 중 하나로, 형광 또는 biotin 등을 표식하는 다양한 면역 화학 기반 기술뿐 아니라 항체와 약물을 결합(Antibody-drug conjugate)시키는 등의 연구로도 많이 활용되고 있다. 그러나, 기존의 항체 표식 방법은 표식 물질의 정제 과정과 긴 반응 시간을 필요로 하는 반면, 다카라의 Capturem™ 기술은 표식 물질을 정제하지 않고도, column을 이용하여 15분 내에 매우 빠르게 항체 표식을 완료할 수 있다.

Cas9을 타겟으로 하는 mouse IgG에 형광과 biotin을 표식한 결과, 표식된 항체는 목적 항원 (antigen)을 정확하게 인식함을 확인하였고, 이로 인해 epitope가 항체 표식 과정에서 어떠한 영향도 받지 않음을 확인하였다.

◆ Capturem™ 항체 표식법의 Workflow
먼저, 항체를 Binding buffer로 희석한 후, column에 binding buffer를 첨가하여 안정화한 다음, 희석된 항체를 column에 loading하고, wash buffer로 세척한다. 표식물질(e.g. 형광, biotin 등)을 적절한 용액에 녹인 후, column에 분주하여 항체를 표식한다. 최소 한번 이상 세척한 후, 적절한 elution buffer로 항체를 회수한다. 표식 과정은 15분 안에 완료할 수 있다. (그림 1)

그림 1. Capturem™ 항체 표식법의 Workflow
◆ 사용제품
Capturem™ Protein G Miniprep (Code 635725)

◆ Fluorescein을 이용한 형광 표식 (Fluorescein labeling)
Capturem™을 이용해 항체의 형광 표식 효율을 검증하기 위해, Fluorescein-NHS를 표식하였다. 먼저, hybridoma 배지에서 Cas9 단백질을 특이적으로 검출하는 mouse IgG를 정제하였다. 이후, 프로토콜에 따라 column을 이용해 150 μg의 항체에 Fluorescein-NHS를 표식하였고, wash와 elution 과정을 거쳐 형광이 표식된 항체 40 μg를 얻었다. 흡광기를 이용해, 형광과 항체의 molar ratio를 측정하였다. Fluorescein-NHS의 양을 다양하게 설정함으로써 (12 eq.* 20 eq.* 50 eq.*, 혹은 100eq.*, 항체 당 형광 분자의 당량을 2.97~3.3의 조건으로 확인하였다. Fluorescein-NHS의 molar ratio를 증가시켰음에도, 항체에 대한 표식 비율은 크게 변화하지 않았으며, 12 eq.*, 20 eq.*에서 가장 좋은 결과를 얻었다. 더 높은 molar ratio로 표식한 샘플 (50 eq.*, 100 eq.*)에서는 표식되지 않은 형광이 다량 회수 되었다. (그림 2)
* eq.은 stands for molar equivalent, 몰당량을 의미한다.


그림 2. 표식 반응에서 fluorescein 농도가 높아질수록, 항체와 fluorescein 비율이 증가한다.

왼쪽의 전기 영동 사진은 각 well에서의 fluorescence intensity를 나타내며, 이를 통해 표식 반응에서 fluorescein 신호가 높아질수록, 항체 당 형광 물질 비율이 증가함을 확인하였다. 오른쪽의 Coomassie 젤 염색 사진을 통해 각 well에 포함된 항체의 양이 동일함을 확인하였다. (nc: Negative control, Lane 1: 12 eq.*, Lane 2: 20 eq.*, Lane 3: 50 eq.*, Lane 4: 100 eq.*)
* eq.은 stands for molar equivalent, 몰당량을 의미한다.

◆ Biotin을 이용한 항체 표식 (Antibody biotinylation)
FACS나 imaging, ELISA를 위한 형광 표식과 같이, biotin을 이용한 항체 표식 또한 일반적으로 사용된다. 형광 표식과 비슷한 방법으로, Cas9을 특이적으로 검출하는 mouse IgG에 biotin-NHS를 표식했다. (그림 3)


그림 3. Western blot을 이용해 Capturem™으로 정제된 항체 확인 (좌), biotin 표식 항체를 이용해 검출한 재조합 Cas9 단백질의 확인 (우)
왼쪽 Western blot 결과를 통해, 1, 2번 lane에서 모두 90% 이상의 biotin 표식 항체가 회수되었음을 확인하였다. 오른쪽 Western blot 결과를 통해, biotin 표식된 anti-Cas9 항체가 각 lane에 로딩된 100-300 ng의 Cas9을 검출할 수 있음을 확인하였다. 이는, anti-Cas9 항체에 biotin을 표식하고, Capturem™ Protein G Miniprep column로 회수된 후에도, binding epitope가 활성 상태를 유지함을 나타낸다.