human PBMC로부터 iPS cell line 구축

PBMC reprogramming protocol에 따라, Sendai virus와 Cellartis^® DEF-CS™ system를 이용하여 6명의 donor로부터 획득한 human primary peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)를 iPS cell로 reprogramming 한 후, 세포주로 구축하였다 (그림 1).


그림 1. Cellartis^® DEF-CS™ system을 이용한 iPS cell reprogramming timeline

6명의 donor (A-F)로부터 획득한 hPBMC를 이용하여 reprogramming을 진행하였다. 각 donor별hPBMC 10⁶개를 이용하여 순차적으로 형질 도입하였다. 이를 통해 많은 수의 colony를 획득하였으며, 추가 배양을 위해 각 donor별로 8-30개의 colony를 선별하여 안정적으로 iPS cell을 구축할 수 있었다. Donor에 따라 colony 생존율은 40-75%로 다양하게 확인되었으며, 이 때 생존율은 pluripotency와 성장성을 지니는 colony를 의미한다 (표 1).

Donor	A	B	C	D	E	F
Picked colonies	15	12	12	12	8	8
Generated iPS cell lines	6	9	8	5	6	6
Generated iPS cell lines (%)	40	75	67	41	75	75

표 1. 각 donor의 선별 colony 생존율

각 단계에서 세포의 형태학적 관찰을 진행하였다. Colony를 선별한 후, 형태학적 변화가 확인하였고, Passage 6에서 세포를 동결하여 보관할 수 있을 정도로 안정화 되었다 (그림 2).


각각의 donor로부터 총 6종의 iPS cell line을 구축한 후, Sendai virus가 잔재하고 있는지를 확인하였다. 계대 배양한 세포에서 Real Time PCR을 이용해 Sendai virus RNA 양을 정량적으로 분석하였다. Passage 7-8에서 2/3의 iPS cell line에서 Sendai virus RNA가 검출되지 않았으며, Passage 18에서는 모든 iPS cell line에서 Sendai virus RNA가 검출되지 않았다. 36 cycle 이후에서의 Ct값은 검출되지 않은 것으로 판단하였다 (그림 3)


그림 3. Passage 18 이후에는 모든 iPS cell line에서 Sendai virus가 전혀 검출되지 않았다.

Passage 15의 iPS cell line가 stem cell marker인 Oct4, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81를 발현하고 있는지 immunocytochemistry (ICC)로 확인하였다. 대부분의 세포에서 4종의 stem cell marker를 발현하였으며, negative marker인 SSEA-1는 발현하지 않았다. 핵 염색을 위해 DAPI를 사용하였고, 발현 marker와 핵 염색이 겹치는 부분은 보라색으로 관찰된다 (그림 4).


그림 4. Immunocytochemistry (ICC)를 이용한 stem cell marker 발현 분석

Passage 14-17의 6종의 iPS cell line이 stem cell marker인 Oct4를 발현하고 있는지 Flow cytometry로 확인하였다. 각 세포주들은 거의 100% 수준의 높은 Oct4 발현을 보였다 (그림 5).


그림 5. Flow cytometry를 이용한 Oct4 발현 분석
(Panel A) FACS 결과 (Panel B) Oct4를 발현하는 세포는 99.58% - 99.94% 비중을 차지하고 있다.

구축한 iPS cell line 6종의 pluripotency를 추가로 검증하기 위해, Definitive Endoderm (DE) cell과 hepatocyte로의 분화를 유도하였다. DE로 분화된 세포는 immunocytochemistry (ICC)를 이용해 DE marker인 SOX17과 pluripotency marker인 Oct4의 발현을 확인하였다. 각각의 iPS cell line 대부분에서 SOX17의 발현이 관찰되고, Oct4의 발현은 관찰되지 않아, DE로 분화되었음을 확인하였다. 핵 염색을 위해 DAPI를 사용하였다 (그림 6).


그림 6. DE로 분화한 세포의 형태학적 관찰. DE marker, Sox17 (red). Pluripotency marker Oct4 (green).

30일간의 분화를 유도한 후, hepatocyte로 분화되었는지 확인하기 위해, hepatic marker인 HNF4α, albumin, CYP3A4를 ICC로 확인하였다. 대부분의 세포에서 HNF4α를 발현함을 확인하고, albumin과 CYP3A4는 몇몇의 세포에서 이중 염색되었음을 확인하였다. 핵 염색을 위해 DAPI를 사용하였다. (그림 7).


그림 7. 분화된 Hepatocyte의 형태학적 관찰. Hepatic marker HNF4a, albumin (green), CYP3A4 (red).

[참고 문헌]
Asplund, A. et al. One Standardized Differentiation Procedure Robustly Generates Homogenous Hepatocyte Cultures Displaying Metabolic Diversity from a Large Panel of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. Reports 12, 90-104 (2016).    

Meissner, A., Wernig, M. & Jaenisch, R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1177-81 (2007).  

Schlaeger, T. M. et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat. Biotechnol. 33, 58-63 (2015). 
Takahashi, K. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 131, 861-872 (2007).