human fibroblasts로부터 iPS cell line 구축

PBMC reprogramming protocol에 따라, Sendai virus와 Cellartis^® DEF-CS™ system를 이용하여 3명의 donor로부터 획득한 human fibroblast를 iPS cell로 reprogramming 한 후, 세포주로 구축하였다 (그림 1).


그림 1. Cellartis^® DEF-CS™ system을 이용한 iPS cell reprogramming timeline

3명의 donor (A-C)로부터 획득한 human fibroblast를 이용하여 reprogramming을 진행하였다. 각 donor별 human fibroblast 106개를 이용하여 순차적으로 형질 도입하였다. 이를 통해 많은 수의 colony를 획득하였으며, 추가 배양을 위해 각 donor별로 37-49개의 colony를 선별하여 안정적으로 iPS cell을 구축할 수 있었다. Donor에 따라 colony 생존율은 33-65%로 다양하게 확인되었으며, 이 때 생존율은 pluripotency와 성장성을 지니는 colony를 의미한다 (표 1).

Donor	A	B	C
Picked colonies	15	12	12
Generated iPS cell lines	6	9	8
Generated iPS cell lines (%)	40	75	67

표 1. 각 donor의 선별 colony 생존율

각 단계에서 세포의 형태학적 관찰을 진행하였다. Colony를 선별한 후, 형태학적 변화를 확인하였고, 배양 22일차의 Passage 6에서 세포를 동결하여 보관할 수 있을 정도로 안정화 되었다 (그림 2).


그림 2. Colony를 선별한 후 안정화 되기까지의 형태학적 관찰

3종의 donor cell로부터 각 3종의 iPS cell line을 구축하였으며, 총 9종의 iPS cell line에서 Sendai virus가 잔재하고 있는지를 확인하였다. 계대 배양한 세포에서 Real Time PCR을 이용해 Sendai virus RNA 양을 정량적으로 분석하였다. Passage 7-8에서 2/3의 iPS cell line에서 Sendai virus RNA가 검출되지 않았으며, Passage 11에서는 모든 iPS cell line에서 Sendai virus RNA가 검출되지 않았다. 36 cycle 이후에서의 Ct값은 검출되지 않은 것으로 판단하였다 (표 2).

	Passages 7-8	Passage 11
Number of negative iPS cell lines	6/9	9/9
Percent negative iPS cell lines	67	100

표 2. Real Time PCR을 이용해, 구축된 iPS cell line에서의 Sendai virus RNA 확인

Passage 11의 iPS cell line에서 stem cell marker인 Oct4, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81를 발현하고 있는지 immunocytochemistry (ICC)로 확인하였다. 대부분의 세포에서 4종의 stem cell marker를 발현하였고, negative marker인 SSEA-1는 발현하지 않았다. 핵 염색을 위해 DAPI를 사용하였다. (그림 3).


그림 3. Immunocytochemistry (ICC)를 이용한 stem cell marker 발현 분석

[참고 문헌]
Asplund, A. et al. One Standardized Differentiation Procedure Robustly Generates Homogenous Hepatocyte Cultures Displaying Metabolic Diversity from a Large Panel of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. Reports 12, 90-104 (2016).    

Meissner, A., Wernig, M. & Jaenisch, R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1177-81 (2007).  

Schlaeger, T. M. et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat. Biotechnol. 33, 58-63 (2015). 

Takahashi, K. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 131, 861-872 (2007).