Achieve the most unbiased, target-specific preamplification

• 10 pg과 같이 극소량의 샘플로부터 preamplification
• 그 어떤 제품보다도 낮은 편향성으로 preamplification
• FFPE 조직의 preamplification으로 162개의 유방암 관련 유전자 확인

Introduction
Real Time PCR (qPCR), SNP genotyping, target enrichment는 연구와 임상 적용에서 모두 많이 사용되는 분자적 분석 기법이지만, FFPE 조직에서 유래한 핵산 혹은 체액 등에 존재하는 희석된 샘플과 같이 아주 적은 양의 샘플에서는 적용이 어렵다는 한계가 있다.
“Booster PCR”이라고도 불리는 preamplification을 이용하면 이 한계를 극복할 수 있으며, target 특이적인 cDNA와 gDNA를 편향성 없이 증폭할 수 있다. Preamplification을 진행할 때 사용하는 enzyme이 얼마나 적은 양에 적용 가능한지, 편향성 없이 얼마나 민감도 있게 증폭이 가능한지가 가장 중요하다. 몇몇 타겟 유전자에 대해 PCR 효율이 낮은 경우에 편향성이 발생할 수 있고, 이로 인해 샘플 분석의 재현성이 낮아지면서 downstream 실험에도 영향을 미친다.
다카라바이오는 모든 타겟 유전자에서 편향성 없이 preamplification을 진행할 수 있도록 Prelude™ PreAmp Master Mix를 개발하였으며, 이는 최적화 된 Polymerase와 PCR 효율을 극대화 할 수 있는 buffer로 구성되어 있다. 본 제품을 이용하면 10 pg의 아주 적은 양의 cDNA와 gDNA로부터 100개 이상의 타겟을 편향성 없이 preamplification할 수 있다.

Superior preamplification of 162 breast cancer-related genes in FFPE tissue
Prelude™ PreAmp Master Mix를 이용해, FFPE 조직을 preamplification한 후 162개의 유방암 유전자 분석 panel로 분석하였다. NucleoSpin total RNA FFPE를 이용해 FFPE 샘플로부터 RNA를 추출하였고, PrimeScript™ RT Master Mix를 이용해 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 Prelude™ PreAmp Master Mix를 이용해 preamplification한 후, SmartChip™ System과 SmartChip™ TB Green^® Master Mix를 이용해 162개의 유방암 유전자 panel로 분석하였다. ΔΔCt값은 housekeeping 유전자의 평균값을 이용하여 계산되었으며, 모든 분석 값은 plot으로 표기하였다 (그림 1). 샘플의 질이나 분석 성능으로 인한 증폭 시의 편향성을 확인하기 위해, Ct값 ±1.5를 기준으로 확인하였으며, 162개 유전자 중 97%에 해당하는 157개의 유전자가 기준 값 내에서 확인되었다. Preamplification으로 인한 편향성이 많이 나타나는 FFPE 샘플을 이용했음에도 편항성 없는 결과를 확인하였다.


그림 1. Prelude™ PreAmp Master Mix을 이용해 FFPE 샘플의 preamplification을 진행하였을 때, 162개의 유방암 타겟 유전자에서 편향성 없는 증폭 확인

Code	제품명	용량
638541	Prelude™ PreAmp Master Mix	40 회
RR036A	PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)	200 회
640022	SmartChip™ Real-Time PCR System	1 대
640211	SmartChip™ TB Green™ Gene Expression Master Mix	48 ㎖

[원문] Achieve the most unbiased, target-specific preamplification from limited samples using Prelude PreAmp Master Mix