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[Cancer Research] Cancer single cell analysis

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Change of heart: exploring transcriptional variation in cardiomyocytes

Only the ICELL8 system enabled us to address similarities and differences associated with the nuclearity of cells. Moreover, large cells such as cardiomyocytes are easily damaged during isolation, causing profound changes in the RNA content. The ICELL8 system allows rigorous quality control of analyzed cells, which is very helpful to avoid misinterpretation of sequencing data."
-Dr. Thomas Braun, corresponding author

생물학적 현상을 연구하는 과정에서 연구자들은 종종 특정 세포 유형이나 생물학적 모델을 이용하는 데에 어려움이 있어 한계를 느낄 수 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 다카라바이오는 ICELL8 system을 지원함으로써, 기존의 방법으로는 분석이 어려웠던 세포에서도 유연한 open platform으로 single cell sequencing 분석을 가능케 했다. 그 예로, 성체 마우스 심근세포의 scRNA-seq 분석법을 개발한 Max Planck Institute for Heart and Lung Research의 연구를 살펴봤다 (자세한 프로토콜을 확인하시려면 클릭하세요).

Matters of the heart
대부분의 체세포는 diploid 형태지만, 성인 심근세포의 염색체 수는 다양하며, 가장 일반적인 형태는 하나의 세포에 두개의 염색체를 가지는 두개의 핵을 가진다. Yekelchyk et al. 는 단핵, 다핵의 변이를 가지는 심근세포에서 전사체의 발현 차이가 존재하는지, 그로 인한 기능 변화를 유발하는지 확인하고자 했다.
scRNA-seq은 이를 확인하기 위한 최적의 실험방법이지만, 성체 심근세포의 크기가 매우 크기 때문에 microfluidic과 droplet에 기반한 scRNA-seq 방법에 적용하기 어려웠다. 또한, scRNA-seq 전 각 세포의 수가 정확하게 확인되지 않으면 분석 과정에서 해당 정보가 손실될 수 있어 실험에 어려움이 있었다.
이를 극복하기 위해, 연구자들은 최대 200 μm정도의 큰 크기의 심근세포에도 적용 가능한 ICELL8 system을 이용하였다. 심근세포 부유액은 시간이 지남에 따라 침강될 수 있어, 연구자들은 샘플을 자주 섞어 분주할 수 있도록 dispense protocol을 수정함으로써, ICELL8 chip 내에 심근세포를 균일하게 분주할 있었다 (그림 1).


그림 1. ICELL8 chip에 균일하게 분주한 심근세포
Panel excerpts from Yekelchyk et al. 2019 Supplementary Material Figure 1, used and adopted under CC-BY 4.0). In both panels, the colors represent the relative numbers of cells in the microwells.
(Panel A) The default dispensing protocol results in a heterogeneous distribution of cardiomyocytes, due to their high sedimentation rate.
(Panel B) The modified dispensing protocol distributes cardiomyocytes evenly across the chip.

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scDNA-seq 실험 결과를 살펴 보았을 때, 심근 세포는 두 개의 군집으로 나뉘었으며 검출된 유전자의 수가 이에 관련이 있음을 확인할 수 있었다 (그림 2, Panel A). ICELL8® system은 세포를 분주한 후의 이미지를 살펴볼 수 있기에, 이를 sequencing 결과와 연계하여 분석할 수 있었다. Cluster 1로 분류된 세포에서는 막대 모양이 아니거나 크기가 작고, 흐릿하게 관찰되는 것으로 보아, RNA degradation이 발생한 것으로 보였다 (그림 2, Panel A, B).
이후, 연구자들은 세포 이미지를 기반으로 손상되지 않은 심근세포만 분석할 수 있도록 설정하였다. 이를 통해, 세포의 크기와 관계없이 평균 0.6 백만개의 read와 세포 당 3900개의 유전자가 검출되었으며, ploidy가 심근세포의 전사체에 미치는 영향이 크지 않음을 확인하였다.


그림 2. 이미지 기반으로 확인한 심근세포에서의 scRNA-seq 결과
Panel excerpts from Figure 1 of Yekelchyk et al. 2019, used and adopted under CC-BY 4.0
(Panel A) Initial PCA plot shows clustering of cardiomyocytes into two subgroups.
(Panel B) Images of cardiomyocytes in cluster 1 and 2 before library preparation (two-channel reflection mode: DAPI and Cell Tracker [Texas Red]). Quality control reveals that cells in cluster 1 are damaged.
(Panel C) PCA plot of intact rod-shaped cardiomyocytes.

연구자들은 심장 비대증과 같은 병리학적 조건에서의 Heterogeneity 변화에 대해서 확인하였다. 심장이 비대해짐에 따라, 심근 세포의 Ploidy 형태보다는 국소 조직으로부터 유발되는 것으로 보이는 전사적 차이를 확인하였다.

Making single-cell sequencing more accessible
Single cell sequencing은 정상 상태와 질병 상태의 세포의 특성을 이해하는 데 유용하게 활용될 수 있다. 다만, 다양한 세포에 적용할 수 있는 적절한 기기와 방법이 요구되며, ICELL8® system은 세포의 크기와 상관없이 작은 핵부터 심근 세포와 같은 크기가 큰 세포까지 다양한 크기의 세포를 적용 가능할 뿐 아니라, 맞춤형 분석법을 새로 개발하고 최적화 할 수 있는 유연성과 연구의 심층적 이해를 돕기 위한 세포의 이미지를 제공한다. ICELL8® system을 이용해 Max Planck 연구원들은 손상되지 않은 정상 심근 세포로부터 scRNA-seq을 진행한 바 있으며, 이는 다양한 scRNA-seq을 위한 개방적이고 유연한 시스템 활용의 많은 예시 중 하나다.

Code

제품명

용량

640189

ICELL8® cx Single-Cell System

1 system


[원문] Change of heart: exploring transcriptional variation in cardiomyocytes
[참고문헌]
- Yekelchyk, M., Guenther, S., Preussner, J. & Braun, T. Mono- and multi-nucleated ventricular cardiomyocytes constitute a transcriptionally homogenous cell population. Basic Res. Cardiol. 114, 36 (2019).