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[Cancer Research] Immunotherapy
TCR-seq methods: strengths, weaknesses, and rankings
T 세포는 면역 종양학이나 자가면역질환과 같은 적응 면역 반응을 조절하는 세포로, 이를 분석함으로써 면역 시스템의 복잡성을 연구할 수 있다. TCR (T cell receptor) repertoire를 연구하기 위한 여러 방법 중에서도, NGS를 이용하는 것은 가장 종합적인 분석이 가능하며 TCR-seq이라고 불리운다.
안타깝게도 NGS를 위해 상용화된 제품이나 protocol이 모두 동일하게 TCR을 분석할 수 있는 것은 아니다. 분석법에 따라 효율이 달라질 수 있기에, 다양한 방법 중에서 가장 좋은 결과를 얻을 수 있는 방법을 찾는 것이 매우 중요하다.
The fundamentals of TCR-seq
[DNA vs. RNA template]
대부분의 TCR-seq 방법은 초기 샘플을 어떤 걸로 사용하느냐에 따라 분류해 볼 수 있다. DNA를 이용하는 경우는 세포 당 하나의 template를 이용하기에 각 TCR clone을 정량화할 때 적합하나, 다소 비용이 많이 소요된다는 단점이 있다. RNA를 이용하는 경우에는 보다 민감하게 TCR에서 발현하는 유전자를 다수 확인할 수 있으며, unique molecular index (UMI)를 적용하여 PCR로 인한 오류나 편향성을 감소시켜 희귀 돌연변이 등을 정확하게 식별할 수 있다.
[CDR3 only vs. full-length sequence]
대부분의 immune profiling 실험은 TCR, BCR 서열 내 CDR3 영역의 분석에 초점이 맞춰져 있다. CDR3 영역은 항원과 receptor 사이의 상호작용에 관여하는 중점 영역으로서, 가장 변이가 많이 확인된다. 그러나, Full-length sequencing은 항원과 receptor의 결합이나 downstream signaling 역할의 CDR1, CDR2도 함께 분석할 수 있어, clone을 직접 복제하고 분별해 내기 더 쉽고 receptor 내의 immune repertoire 서열 분석도 용이하다. 이 방식은 항체 치료제나 T 세포 치료제 연구에도 중요하게 활용 가능하다.
[Bulk vs. single-cell analysis]
실험 목표에 따라, Single cell 수준 혹은 bulk cell 수준으로의 분석 방법이 달라진다. 일반적으로 Immune repertoire 다양성 분석은 bulk 수준의 접근법에 의존하여 진행된 반면, 특정 항원을 이용한 TCR/BCR 서열 식별은 single cell 수준의 접근법을 이용해 왔다. Bulk 수준의 분석은 한번의 실험으로 더 많은 서열을 알 수 있으나 비용이 많이 요구된다. 기능적인 TCR은 alpha chain과 beta chain 쌍으로 구성되어 있으며, BCR은 heavy chain과 light chain 쌍으로 구성되어 있어, 이를 이용해 TCR과 BCR 분자를 구분해낼 수 있다. 각각의 T 세포와 B 세포가 발현하는 단일 receptor 서열을 이용해서, single-cell 수준의 분석으로 서열과 염기 쌍 정보를 모두 확인할 수 있으나, 한번에 분석 가능한 샘플 수에 한계가 있다. 연구자들은 처음 Bulk 수준으로 분석을 시작하여 결합 친화성이나 목적 표현형을 가지는 single cell 수준으로 보다 연구를 확장할 수 있다.
[NGS library prep : multiplex PCR vs. 5’ RACE-PCR]
화학적 관점에서 살펴보면, Multiplex PCR (mPCR)과 Rapid Amplification of cDNA Ends PCR (5’ RACE-PCR)이 가장 일반적이다. mPCR의 경우 모든 V, J germline 유전자 (C gene)를 표적으로 하는 primer pool을 이용하여 전체의 V(D)J 재배열 혹은 CDR3 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 반면 증폭 과정에서 편향성이 발생하거나 잘못된 서열의 증폭으로 결과가 왜곡될 수 있다는 한계가 있다. 한편, RNA 특이적 5’ RACE-PCR은 mRNA 전사체 내의 C gene 영역을 표적하는 단일 primer를 이용하기에, PCR bias를 최소화 할 수 있다.
그림 1. 면역 레파토리 분석을 위한 sequencing lbrary 제작 방법의 비교
5′ RACE, shown here as part of the overall workflow for our SMARTer TCR and BCR profiling kits, enables the capture of full-length receptor sequences from mRNA without relying on multiple degenerate primers that overlap regions of variability. Multiplex PCR can use DNA or RNA as template, but often requires sample-specific optimization to avoid PCR bias arising from the use of the aforementioned degenerate primers. In the example schematic for a resulting sequencing-ready library, P5 and P7 refer to Illumina flow cell binding sites added by the primers during library preparation. Primers throughout the diagram are shown as left- and right-pointing arrows along the templates.
Unpacking replicability and reproducibility of popular TCR-seq methods
TCR-seq 방법을 선택할 때에는 재현성, 복제능, 감도, 특이성, 총 4가지 요소를 고려해야 한다. 최근 Nature Biotechnology 발표된 Barennes et al. 연구에서는 학술적, 상업적 목적으로 자주 사용되는 mPCR, 5’ RACR-PCR 기반의 9가지 library prep 방법을 비교해서 가장 정확하고 결과가 만족스러운 제품을 확인하였다. 이 과정에서 샘플 양의 차이로 인한 영향을 최소화하기 위해 동일한 T 세포를 샘플로 사용하였다.
그 결과로 mPCR 방법에서는 Adaptive Technology사의 immunoSEQ, RACE 방법에서는 다카라바이오의 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit과 Eugster et al. 로 발표된 template switch oligo를 이용한 homebrew 방법에서 가장 좋은 결과를 얻었다.
Conclusions
다카라바이오의 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit는 TCR α/β (TRA/TRB) repertoire profiling를 정확하게 분석할 수 있을 뿐 아니라, 본 논문에서 다른 8가지 방법에 비해 높은 재현성, 복제능, 감도, 특이성을 확인했다. 해당 제품은 UMI와 UDI를 포함한 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit v2로 업그레이드 되어, 정확도가 개선되었다.
[원문] TCR-seq methods: strengths, weaknesses, and rankings & 4 factors to consider for immune repertoire profiling
[참고문헌] References and product citations
- Barennes, P. et al. Benchmarking of T cell receptor repertoire profiling methods reveals large systematic biases. Nature Biotechnology, 1-10 (2020).
- Eugster, A. et al. Measuring T cell receptor and T cell gene expression diversity in antigen-responsive human CD4+ T cells. Journal of Immunological Methods, 400-401(1), 13-22 (2013).
T 세포는 면역 종양학이나 자가면역질환과 같은 적응 면역 반응을 조절하는 세포로, 이를 분석함으로써 면역 시스템의 복잡성을 연구할 수 있다. TCR (T cell receptor) repertoire를 연구하기 위한 여러 방법 중에서도, NGS를 이용하는 것은 가장 종합적인 분석이 가능하며 TCR-seq이라고 불리운다.
안타깝게도 NGS를 위해 상용화된 제품이나 protocol이 모두 동일하게 TCR을 분석할 수 있는 것은 아니다. 분석법에 따라 효율이 달라질 수 있기에, 다양한 방법 중에서 가장 좋은 결과를 얻을 수 있는 방법을 찾는 것이 매우 중요하다.
The fundamentals of TCR-seq
[DNA vs. RNA template]
대부분의 TCR-seq 방법은 초기 샘플을 어떤 걸로 사용하느냐에 따라 분류해 볼 수 있다. DNA를 이용하는 경우는 세포 당 하나의 template를 이용하기에 각 TCR clone을 정량화할 때 적합하나, 다소 비용이 많이 소요된다는 단점이 있다. RNA를 이용하는 경우에는 보다 민감하게 TCR에서 발현하는 유전자를 다수 확인할 수 있으며, unique molecular index (UMI)를 적용하여 PCR로 인한 오류나 편향성을 감소시켜 희귀 돌연변이 등을 정확하게 식별할 수 있다.
[CDR3 only vs. full-length sequence]
대부분의 immune profiling 실험은 TCR, BCR 서열 내 CDR3 영역의 분석에 초점이 맞춰져 있다. CDR3 영역은 항원과 receptor 사이의 상호작용에 관여하는 중점 영역으로서, 가장 변이가 많이 확인된다. 그러나, Full-length sequencing은 항원과 receptor의 결합이나 downstream signaling 역할의 CDR1, CDR2도 함께 분석할 수 있어, clone을 직접 복제하고 분별해 내기 더 쉽고 receptor 내의 immune repertoire 서열 분석도 용이하다. 이 방식은 항체 치료제나 T 세포 치료제 연구에도 중요하게 활용 가능하다.
[Bulk vs. single-cell analysis]
실험 목표에 따라, Single cell 수준 혹은 bulk cell 수준으로의 분석 방법이 달라진다. 일반적으로 Immune repertoire 다양성 분석은 bulk 수준의 접근법에 의존하여 진행된 반면, 특정 항원을 이용한 TCR/BCR 서열 식별은 single cell 수준의 접근법을 이용해 왔다. Bulk 수준의 분석은 한번의 실험으로 더 많은 서열을 알 수 있으나 비용이 많이 요구된다. 기능적인 TCR은 alpha chain과 beta chain 쌍으로 구성되어 있으며, BCR은 heavy chain과 light chain 쌍으로 구성되어 있어, 이를 이용해 TCR과 BCR 분자를 구분해낼 수 있다. 각각의 T 세포와 B 세포가 발현하는 단일 receptor 서열을 이용해서, single-cell 수준의 분석으로 서열과 염기 쌍 정보를 모두 확인할 수 있으나, 한번에 분석 가능한 샘플 수에 한계가 있다. 연구자들은 처음 Bulk 수준으로 분석을 시작하여 결합 친화성이나 목적 표현형을 가지는 single cell 수준으로 보다 연구를 확장할 수 있다.
[NGS library prep : multiplex PCR vs. 5’ RACE-PCR]
화학적 관점에서 살펴보면, Multiplex PCR (mPCR)과 Rapid Amplification of cDNA Ends PCR (5’ RACE-PCR)이 가장 일반적이다. mPCR의 경우 모든 V, J germline 유전자 (C gene)를 표적으로 하는 primer pool을 이용하여 전체의 V(D)J 재배열 혹은 CDR3 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 반면 증폭 과정에서 편향성이 발생하거나 잘못된 서열의 증폭으로 결과가 왜곡될 수 있다는 한계가 있다. 한편, RNA 특이적 5’ RACE-PCR은 mRNA 전사체 내의 C gene 영역을 표적하는 단일 primer를 이용하기에, PCR bias를 최소화 할 수 있다.
그림 1. 면역 레파토리 분석을 위한 sequencing lbrary 제작 방법의 비교
5′ RACE, shown here as part of the overall workflow for our SMARTer TCR and BCR profiling kits, enables the capture of full-length receptor sequences from mRNA without relying on multiple degenerate primers that overlap regions of variability. Multiplex PCR can use DNA or RNA as template, but often requires sample-specific optimization to avoid PCR bias arising from the use of the aforementioned degenerate primers. In the example schematic for a resulting sequencing-ready library, P5 and P7 refer to Illumina flow cell binding sites added by the primers during library preparation. Primers throughout the diagram are shown as left- and right-pointing arrows along the templates.
Unpacking replicability and reproducibility of popular TCR-seq methods
TCR-seq 방법을 선택할 때에는 재현성, 복제능, 감도, 특이성, 총 4가지 요소를 고려해야 한다. 최근 Nature Biotechnology 발표된 Barennes et al. 연구에서는 학술적, 상업적 목적으로 자주 사용되는 mPCR, 5’ RACR-PCR 기반의 9가지 library prep 방법을 비교해서 가장 정확하고 결과가 만족스러운 제품을 확인하였다. 이 과정에서 샘플 양의 차이로 인한 영향을 최소화하기 위해 동일한 T 세포를 샘플로 사용하였다.
그 결과로 mPCR 방법에서는 Adaptive Technology사의 immunoSEQ, RACE 방법에서는 다카라바이오의 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit과 Eugster et al. 로 발표된 template switch oligo를 이용한 homebrew 방법에서 가장 좋은 결과를 얻었다.
Conclusions
다카라바이오의 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit는 TCR α/β (TRA/TRB) repertoire profiling를 정확하게 분석할 수 있을 뿐 아니라, 본 논문에서 다른 8가지 방법에 비해 높은 재현성, 복제능, 감도, 특이성을 확인했다. 해당 제품은 UMI와 UDI를 포함한 SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit v2로 업그레이드 되어, 정확도가 개선되었다.
Code |
제품명 |
용량 |
634431 |
96 회 |
|
634478 |
12 회 |
|
640182 |
1 Chip |
[원문] TCR-seq methods: strengths, weaknesses, and rankings & 4 factors to consider for immune repertoire profiling
[참고문헌] References and product citations
- Barennes, P. et al. Benchmarking of T cell receptor repertoire profiling methods reveals large systematic biases. Nature Biotechnology, 1-10 (2020).
- Eugster, A. et al. Measuring T cell receptor and T cell gene expression diversity in antigen-responsive human CD4+ T cells. Journal of Immunological Methods, 400-401(1), 13-22 (2013).