´Ý±â
TaKaRa
Á¦Ç°¸í/Á¦Ç°ÄÚµå
Å°¿öµå°Ë»ö
°Ë»ö
´Ý±â
  • °í°´Áö¿ø 
  • ¾÷¹«¾È³»¦¢Á¦Ç°¹®ÀÇ
  • ÀüÈ­¹øÈ£¦¢02-2081-2510
  • Email     ¦¢support@takara.co.kr
  • ´ëÀüÁö»ç 
  • ¾÷¹«¾È³»¦¢´ëÀü/ÃæûÁö¿ª ÁÖ¹®, Á¦Ç°¹®ÀÇ
  • ÀüÈ­¹øÈ£¦¢042-828-6525
  • Email     ¦¢tkbd@takara.co.kr
  • ¾÷¹«½Ã°£¾È³»
  • [ Æò¡¡¡¡ÀÏ ] 09 : 00 ~ 18 : 00 ¦¢ [ Á¡½É½Ã°£ ] 12 : 00 ~ 13 : 00
  • Å䡤ÀÏ¿äÀÏ, °øÈÞÀÏÀº ÈÞ¹«ÀÔ´Ï´Ù.
Home > ÀüÁ¦Ç°º¸±â > NGS °ü·Ã > Low Input DNA-Seq > [Àû¿ë] ThruPLEX¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ cfDNA-seq

[Àû¿ë] ThruPLEX¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ cfDNA-seq

-



cfDNA ºÐ¼®À» À§ÇÑ plasma sample preparation

¡ß Introduction
Á¶Á÷ »ý°ËÀ» ÀÌ¿ëÇÑ ºÐÀÚÇÐÀû ºÐ¼®Àº ¾ÏÀ» ÅëÂû·Â ÀÖ°Ô ¿¬±¸ÇÒ ¼ö ÀÖ´Â ¹æ¹ýÀÌÁö¸¸, ºÐ¼®ÇÏ°íÀÚ ÇÏ´Â Á¶Á÷ÀÇ Á¾·ù¿¡ µû¶ó »ùÇÃÀ» ¾ò´Â °ÍÀÌ Èûµé°í, ħ½ÀÀûÀ¸·Î »ùÇÃÀ» äÃëÇÏ´Â °úÁ¤¿¡¼­ °Ë»ç ´ë»óÀÌ ºÒÆíÇϰųª À§ÇèÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù´Â ÇѰ踦 °¡Áø´Ù. ±Ã±ØÀûÀ¸·Î´Â ÀÌ·± ÇÑ°è·Î ÀÎÇØ ¾ò°Ô µÇ´Â »ùÇà ¼ö°¡ Á¦ÇÑÀûÀÌ°Ô µÈ´Ù. °Ô´Ù°¡, ¾Ï¼¼Æ÷°¡ Áö¼ÓÀûÀ¸·Î µ¹¿¬º¯À̸¦ À¯¹ßÇÏ°í ÁøÈ­ÇÑ´Ù´Â Á¡À» °¨¾ÈÇÒ ¶§, ÇÑ °³ÀÎÀÌ °¡Áö´Â ¾Ï¼¼Æ÷´Â heterogeneousÇÑ À¯Àü Á¤º¸¸¦ °¡Áö´Â °æ¿ì°¡ ¸¹´Ù. °á°úÀûÀ¸·Î, Á¶Á÷ »ý°ËÀº ¾Ï¼¼Æ÷ Áß ÀϺο¡ ´ëÇÑ À¯Àü Á¤º¸¸¸ ³ªÅ¸³¾ ¼ö ÀÖ¾î, ÀüüÀûÀÎ µ¹¿¬º¯ÀÌ Á¤º¸¸¦ ºÐ¼®Çϱ⿡´Â ÃæºÐÄ¡ ¸øÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù. ¶ÇÇÑ, Á¶Á÷ »ý°ËÀº äÃëµÈ ½ÃÁ¡¿¡¼­ÀÇ ¾ç»ó¸¸À» È®ÀÎÇÒ ¼ö Àֱ⿡, ½Ã°£ °æ°ú¿¡ µû¶ó ¾ÏÀÇ ÁøÇà ¶Ç´Â Ä¡·á ¹ÝÀÀ µîÀ» È®ÀÎÇϱâ À§ÇØ ÈļÓÀûÀ¸·Î »ý°ËÀÌ ÇÊ¿äÇÏ´Ù´Â °Íµµ °í·ÁÇØ¾ß ÇÑ´Ù. ÀÌ´Â Ãʱ⠾ÏÀÇ ¹ß´Þ ´Ü°è¸¦ ¿¬±¸ÇÏ°íÀÚ Çϰųª, ¾Ï °ËÃâ°ú ¸ð´ÏÅ͸µÀ» À§ÇÑ ¹ÙÀÌ¿À ¸¶Ä¿¸¦ ¿¬±¸ÇÏ°íÀÚ ÇÒ ¶§ ÇÑ°è·Î ÀÛ¿ëÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù.
ÃÖ±Ù¿¡´Â Ç÷¾× ³»¿¡ Á¸ÀçÇÏ´Â cfDNA³ª miRNA¿Í °°Àº circulating nucleic acidÀ» ÀÌ¿ëÇÑ ¾×ü »ý°ËÀ» ºÐ¼®ÇÔÀ¸·Î½á, Á¶Á÷ »ý°ËÀÇ ÇÑ°è¿Í ħ½ÀÀ» ÃÖ¼ÒÈ­ ÇÏ´Â ¹æ½ÄÀÌ °¢±¤¹Þ°í ÀÖ´Ù (Larrea et al. 2016; Neumann et al. 2018). Digital PCR°ú NGS ±â¼úÀÇ Áøº¸·Î »ùÇà ³» ¾ÆÁÖ ÀûÀº ¾çÀÇ DNA¸¦ Æ÷ÇÔÇÏ°í ÀÖ´õ¶óµµ ³ôÀº ¹Î°¨µµ¿Í ƯÀ̼ºÀ¸·Î À̸¦ °ËÃâÇÒ ¼ö ÀÖ°Ô µÇ¸é¼­, ¾×ü »ý°ËÀ» ÀÌ¿ëÇÑ ºÐ¼® ¹æ½ÄÀÇ È°¿ëÀÌ ¿ëÀÌÇØÁ³´Ù. ¾×ü »ý°ËÀ» À§Çؼ­´Â EDTA³ª cell-free DNA BCT (i.e., ¡°Streck¡±)¿Í °°Àº Ç×ÀÀ°íÁ¦°¡ ó¸®µÈ Ç÷¾×À» äÃëÇØ ÃþÀ» ºÐ¸®ÇÏ°í, Ç÷Àå »óÃþ¾×¿¡¼­ circulating nucleic acid¸¸À» Á¤Á¦ÇÏ¿© »ç¿ëÇÏ°Ô µÈ´Ù.
Circulating nucleic acid´Â Ç÷¾× ³» ³·Àº ³óµµ·Î Á¸ÀçÇÏ°í Àֱ⿡, ºÐ¼®¿¡ ÀûÇÕÇÑ Á¤µµÀÇ ¾çÀ» ¾òÀ¸·Á¸é »ó´çÇÑ ¾çÀÇ Ç÷¾×ÀÌ ¿ä±¸µÈ´Ù. ´ÙÄ«¶ó¹ÙÀÌ¿À´Â ÀûÀº ¾çÀÇ cfDNAµµ ºÐ¼®ÇÒ ¼ö ÀÖµµ·Ï ThruPLEX¢ç DNA-Seq Kit¸¦ Áö¿øÇÏ°í ÀÖÀ¸¸ç, À̸¦ ÀÌ¿ëÇϸé 50 pg ¼öÁØÀÇ DNAµµ NGS ºÐ¼®À» À§ÇÑ library·Î Á¦ÀÛÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù.

¡ß Required material for plasma preparation
- ½ÇÇè¿ë ±Û·Îºê, ¼Òµ¶Á¦, ¸éºÀ, Åä´ÏÄÏ (ÁöÇ÷´ë)
- BD Vacutainer Venous Blood Collection Tubes with K2 EDTA, 10 mL (Becton Dickinson, Cat. No. 366643)
- ¿ø½ÉºÐ¸®¿ë 15 §¢, 50 §¢ Æ©ºê
- 1,500g·Î ÀÛµ¿ °¡´ÉÇÑ ¿ø½ÉºÐ¸®±â
- -70¡ÆC ȤÀº ±× ÀÌÇÏÀÇ freezer (ȤÀº µå¶óÀ̾ÆÀ̽º º¸°ü¿ë±â)

¡ß Protocol of plasma preparation
[ Blood draw ]
1. K2 EDTA¸¦ Æ÷ÇÔÇÏ´Â Vacutainer¿¡ ¸ÕÀú Á¤º¸¸¦ ±âÀçÇÏ°í, Ç÷¾×À» äÃëÇÑ´Ù.
2. Vacutainer Á¦Ç° ¼³¸í¼­¿¡¼­ ¾È³»ÇÏ´Â °Í°ú °°ÀÌ collection tube ³» ÃæºÐÈ÷ äÇ÷µÇ¾ú´ÂÁö È®ÀÎÇÑ´Ù. ±ÇÀåÇÏ´Â ¾çº¸´Ù ÀûÀº ¾çÀÇ Ç÷¾×Àº ±ÇÀåÇÏÁö ¾Ê´Â´Ù. ÀÌ ¿ÜÀÇ Ã¤Ç÷ °úÁ¤Àº VacutainerÀÇ Á¦Ç° ¼³¸í¼­¿¡ µû¸¥´Ù.
3. äÇ÷ÀÌ ¿Ï·áµÈ Áï½Ã, ¾à 10ȸ Á¤µµ ³Ê¹« ¼¼Áö ¾Ê°Ô Æ©ºê¸¦ À§¾Æ·¡·Î µÚÁý´Â´Ù. (´Ù¸¥ Æ©ºê¸¦ äÇ÷ÇÏ´Â Áß¿¡ À§¾Æ·¡·Î µÚÁý¾îµµ ±¦Âú´Ù.)
4. ¿ø½ÉºÐ¸® Àü 30ºÐ°£ »ó¿Â¿¡¼­ äÇ÷ Æ©ºê¸¦ º¸°üÇÑ´Ù. ¿ø½ÉºÐ¸®±â°¡ ³·Àº ¿Âµµ¿¡¼­ÀÇ ÀÛµ¿µÇ´Â °æ¿ì, ½Ã°£À» ´ÜÃàÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù.

    NOTE: °Ëü´Â äÇ÷ ÈÄ 4½Ã°£ À̳»¿¡ ¸ðµÎ ó¸®ÇÏ¿© µ¿°á º¸Á¸ÇÑ´Ù.

[ First centrifugation ]
1. ¿Âµµ ¼³Á¤ÀÌ °¡´ÉÇÏ´Ù¸é, ¿ø½ÉºÐ¸®±â¸¦ 4¡ÆC·Î ¼³Á¤ÇÑ´Ù.
2. Collection tube ³» Ç÷¾×À» 1,500g¿¡¼­ 12ºÐ °£ ¿ø½ÉºÐ¸®ÇÑ´Ù.
3. ¿ø½ÉºÐ¸®±â¿¡¼­ Æ©ºê¸¦ ²¨³» ¿ëÇ÷ (bright red plasma)ÀÌ ÀϾ »ùÇÃÀº Æó±âÇÏ°í, ¿ëÇ÷ÀÌ ÀϾÁö ¾ÊÀº Æ©ºê¸¦ ÀÌ¿ëÇؼ­ ´ÙÀ½ ´Ü°è¸¦ ÁøÇàÇÑ´Ù.
4. ¿ø½ÉºÐ¸® ÈÄ¿¡´Â ÀûÇ÷±¸ À§¿¡ ¼Ò·®À¸·Î Á¸ÀçÇÏ´Â buffy coat (ÇϾá»öÀÇ ¼¼Æ÷Ãþ)¸¦ È®ÀÎÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù (±×¸² 1). Buffy coat°¡ Èð¾îÁöÁö ¾Êµµ·Ï ÁÖÀÇÇÑ´Ù.
5. ÀÏȸ¿ë bulb pipette¸¦ ÀÌ¿ëÇØ, °¢ collection tube¿¡¼­ Ç÷ÀåÀ» ¿ø½ÉºÐ¸®¿ë 15 §¢ Æ©ºê·Î ¿Å±ä´Ù.
  • Ç÷ÀåÀ» äÃëÇÒ ¶§ Buffy coat¿¡ Á¸ÀçÇÏ´Â ¼¼Æ÷¸¦ ÃÖ¼ÒÈ­Çϱâ À§Çؼ­´Â Vacutainer tube¸¦ ¶È¹Ù·Î ¼¼¿ö ÀâÀº µÚ, ÇÇÆêÀ» ±â¿ï¿© Ç÷ÀåÀ» »¡¾ÆµéÀ̸鼭 õõÈ÷ ¾Æ·¡·Î À̵¿ÇÑ´Ù.
  • Ç÷Àå ³» ¼¼Æ÷ ¿À¿°À» ¹æÁöÇϱâ À§ÇØ, Ç×»ó buffy coat 5 §® À§³ª Ç÷Àå 1/4 Á¤µµ±îÁö¸¸ »ùÇÃÀ» äÃëÇÑ´Ù. ¸¸ÀÏ Ç÷Àå°ú ÇÔ²² ¼¼Æ÷°¡ äÃëµÈ °æ¿ì¿¡´Â ÀÌ¹Ì Ã¤ÃëÇÑ »ùÇÿ¡ ÷°¡ÇÏÁö ¾Ê°í Áï½Ã Æó±âÇÑ´Ù.

    NOTE: ¿ø½ÉºÐ¸®´Â ±×¸² 1°ú °°ÀÌ ÀûÇ÷±¸¿Í ¹éÇ÷±¸·ÎºÎÅÍ Ç÷ÀåÀ» ºÐ¸®½ÃŲ´Ù. °¡Àå Áß¿äÇÑ °úÁ¤Àº ¿ø½ÉºÐ¸® ÈÄ ÇÇÆêÆÃÀ» ÇÏ´Â °úÁ¤¿¡¼­ buffy coat¸¦ Á¦¿ÜÇÏ°í Ç÷À常 ¾ò´Â °ÍÀ¸·Î, ÃæºÐÇÑ ¿©À¯ º¼·ýÀ» ³²°Ü µÎ°í »ùÇÃÀ» äÃëÇÑ´Ù. ¿©À¯ º¼·ýÀ» ÁÙÀ̸é buffy coatÀÇ È¥ÀÔÀ¸·Î plasma qualityµµ ³·¾ÆÁú ¼ö ÀÖ´Ù.


±×¸² 1. First centrifugation ÀÌÈÄ Ç÷ÀåÀ» äÃëÇÏ´Â °úÁ¤
Take care not to disturb the buffy coat when pipetting.

[ Second centrifugation ]
1. ¿ø½ÉºÐ¸®¿ë 15 §¢ Æ©ºê ³» Ç÷ÀåÀ» 1,500g¿¡¼­ 12ºÐ °£ ¿ø½ÉºÐ¸®ÇÑ´Ù.
2. »õ ÀÏȸ¿ë bulb pipette¸¦ ÀÌ¿ëÇØ, Ç÷Àå »ùÇÃÀ» ¿ø½ÉºÐ¸®¿ë 15 §¢ ȤÀº 50 §¢ Æ©ºê·Î ¿Å±ä´Ù.
3. ¼¼Æ÷ pelletÀ¸·Î ÀÎÇÑ ¿À¿°À» ¸·±â À§ÇØ, ¿ø½ÉºÐ¸®¿ë Æ©ºê ¹Ù´Ú¿¡ ¾î´À Á¤µµÀÇ ÀÜ·® (0.5 §¢ ÀÌ»ó; 12 §® ȤÀº 1/2¡± Á¤µµ ³ôÀÌ)ÀÇ Ç÷ÀåÀ» ³²±ä´Ù.
4. Á¶½É½º·´°Ô pooling tube¸¦ Èçµé¾î Ç÷ÀåÀ» ¼¯¾îÁÖ°í, ÃÑ plasma ¿ë¾× ·®À» ÃøÁ¤ÇÑ´Ù.
5. Ç÷ÀåÀÌ ´ã±ä pooling tube¸¦ ¶È¹Ù·Î ¼¼¿ö, -70¡ÆC ȤÀº -80¡ÆC¿¡ º¸°üÇϰųª, 4½Ã°£ ³» »ç¿ëÇÏ´Â °æ¿ì dry ice¿¡ ÆĹ¯´Â´Ù. ´Ü±â°£ º¸°üÀÌ ÇÊ¿äÇÏ´Ù¸é -20¡ÆC¿¡¼­ overnight º¸°üÀÌ °¡´ÉÇÏ´Ù.
6. »ç¿ëÇϱâ Àü±îÁö »ùÇÃÀ» -70¡ÆC ȤÀº -80¡ÆC¿¡¼­ º¸°üÇÑ´Ù.
7. »ç¿ëµÈ ¸ðµç Æ©ºê¿Í ÇÇÆêÀº »ý¹°ÇÐÀû À¯ÇØ Æó±â¹° (biohazard waste)·Î ¹ö¸°´Ù.


±×¸² 2. Second centrifugation ÀÌÈÄ Ç÷ÀåÀ» äÃëÇÏ´Â °úÁ¤
Leave a residual amount of plasma to avoid contamination with cells.