PCR에서 반응 단가 또는 제한된 샘플의 양이 문제라면 single PCR 대신 multiplex PCR을 사용하여 더욱 효과적인 실험을 진행할 수 있다. 그러나 multiplex PCR에서는 한번의 반응에서 다양한 타겟의 일정한 증폭 효율을 얻기 위한 최적화 과정이 필요하다는 한계가 있다. SuperPlex™ Premix (Code 638543)를 사용하면 다음과 같이 multiplex PCR을 더욱 간단하게 진행할 수 있다.

• 타사 제품 대비 다양한 타겟을 균일하게 증폭하는 multiplex PCR premix
• 타사 제품 대비 반응 시간이 빠른 multiplex PCR premix
• 간단한 workflow : primer, sample, H₂O만 넣으면 준비 끝

■ Introduction
Multiplex PCR을 사용하면 single PCR보다 더 많은 타겟이 증폭되기 때문에, 적은 시간과 실험횟수로도 더욱 많은 정보를 얻을 수 있다. 이러한 이유로 multiplex PCR은 mutation detection이나, pathogen identification, 질병 진단연구, 전염병 스크리닝 등의 분야에서 널리 사용되고 있다.

분자 진단분야의 연구에서는 다수의 샘플에서 제시간 안에 의미 있는 결과를 얻기 위해 실험의 속도와 효율이 매우 중요하다. 실험의 workflow를 개선하면 실험 시간을 절감할 수 있으며, 파이펫 사용 단계를 최소화해 오염이나 에러가 발생할 가능성을 줄이고, 반복작업에서 생길 수 있는 부상의 위험을 최소화할 수 있다. 또한 실험 과정을 단순화하면 연구자들 간의 실험 표준화를 가능하게 하여 스크리닝 프로젝트를 확장하는 것이 용이하다.

Multiplex PCR은 매우 유용한 방법인 반면 실험의 세팅이 쉽지 않다. 이 방법은 긴 시간의 최적화 과정이 필요하고, 또다른 과제로는 primer의 디자인과 모든 primer가 작동하는 PCR 조건을 찾아야하는 점이 있다. 이러한 과정을 단순화하고 실험의 workflow를 간소화하기 위해 multiplex PCR을 사용이 편리한 master mix 시약으로 진행할 수 있는 SuperPlex™ Premix (Code 638543)을 개발했다. SuperPlex™ Premix는 고수율 PCR 효소인 Titanium Taq DNA polymerase 기반의 2X hot strart PCR master mix로 multiplex PCR에 최적화 되어있다. 이 premix 시약에는 multiplex PCR에 필요한 모든 시약이 포함되어 때문에 primer, 주형샘플, H₂O만 넣어주면 간단하게 실험을 진행할 수 있다.

아래는 시중에 판매중인 4개의 multiplex PCR 시약과 SuperPlex™ Premix의 효율을 비교한 데이터이다. SuperPlex™ Premix가 다른 제품과 비교해서 짧은 시간 안에 가장 일정한 효율의 증폭을 보여준다는 것을 확인할 수 있다.

■ Results
SuperPlex Premix provides more uniform multiplex PCR amplification than other premixes
시중에 판매되는 4개의 다른 multiplex PCR용 시약과 SuperPlex™ Premix (Code 638543)의 효율을 비교하였다 (20-plex 반응). SuperPlex™ Premix가 모든 크기의 타겟에서 (human CFTR 유전자의 20개 타겟, 70~697 bp) 가장 일정한 증폭 효율을 보였고, 전기영동 결과 gel에서 모든 밴드가 선명하게 확인되었다 (그림 1. Lane 1). 다른 세 개의 타사 master mix (KAPA (Lane 2), Invitrogen (Lane 3)와 두가지 반응조건의 Qiagen (Lane 5, 6)) 또한 20개의 타겟을 증폭할 수 있었다. 하지만, 여러 primer들의 증폭 효율이 일정하지 않고 크기가 크거나 작은 타겟에서 증폭 효율이 낮아졌다. 또한 NEB의 multiplex master mix (Lane 4)는 20-plex의 증폭이 불가능하였다.

따라서, SuperPlex™ Premix (Code 638543)을 사용하면 일정한 증폭 효율을 제공하는 것뿐만 아니라 최소환의 최적화 과정으로 수많은 primer set의 multiplex PCR을 진행할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
그림 1. SuperPlex™ Premix를 이용한 20-plex multiplex 반응에서의 일정한 증폭 효율
Multiplex PCR은 제조사의 추천 조건에 따라 진행되었다. 각 lane은 다른 PCR premix에 의해 합성된 PCR 산물이며 전기영동 후 EtBr로 염색하여 결과를 확인하였다.

SuperPlex Premix provides faster results than other multiplex PCR premixes
Multiplex PCR은 가장 효율적인 방법으로 가장 많은 양의 데이터를 얻기 위해 진행하는 실험법이므로 SuperPlex™ Premix (Code 638543)는 반응 setup 시간과 전체 실험 시간을 최소화하도록 제작되었다. 아래의 비교자료를 보면 SuperPlex™ Premix가 타사제품 대비 PCR에 가장 짧은 시간이 소요되는 것을 확인할 수 있다

	SuperPlex Premix	KAPA2G Fast Multiplex Mix	Invitrogen Platinum Multiplex PCR Master Mix	NEB Multiplex PCR 5X Master Mix	Qiagen Multiplex PCR Kit, without Q-solution	Qiagen Multiplex PCR Kit, with Q-solution
# PCR cycles recommended	30	30	30	30	35	35
Total recommended cycle time	18분 30초	48분	92분	71분	137분 30초	137분 30초

표 1. 각 제조사의 추천 PCR 반응 시간
SuperPlex™ Premix는 20-plex에서 가장 짧은 반응시간을 가진 multiplex PCR 효소이다.

각 multiplex PCR용 시약으로 human CFTR 유전자의 20개 타겟을 PCR cycles 시간이 가장 짧은 SuperPlex™ Premix (Code 638543)의 반응조건에서 테스트하였다 (그림 2.). 그 결과, SuperPlex™ Premix가 가장 뛰어난 활성을 보였으며, NEB와 Qiagen master mix의 경우 증폭에 실패하였고 (Lane 4~6), KAPA2G 와 Invitrogen의 master mix는 낮은 활성과 smearing 및 amplicon dropout이 확인되었다 (Lane 2~3).

그림 2. 짧은 반응시간에도 SuperPlex™ Premix의 성공적인 증폭 (20-plex multiplex)
표 4에 명시된 SuperPlex™ Premix의 짧은 PCR cycle 조건에서 SuperPlex™ Premix와 타사 multiplex PCR premix 시약의 효율을 비교했다. 각 lane은 다른 PCR premix에 의해 제작된 PCR 산물이며 전기영동 후 결과는 EtBr을 통해 염색되었다.

■ Conclusions
실험 결과, SuperPlex™ Premix (Code 638543)는 시중에 다른 multiplex PCR premix 시약과 비교해서 일정한 효율과 빠른 증폭속도를 가진 시약으로, CFTR 유전자를 타겟하는 20-plex의 PCR 산물이 모두 일정한 증폭 효율을 보이며 가장 짧은 실험시간이 소요되었다.

따라서, SuperPlex™ Premix는 속도, 증폭의 일관성, 사용 편의성에서 강점이 있는 최적의 multiplex PCR 시약이라고 할 수 있다.

■ Method
Multiplex PCR에서 SuperPlex™ Premix (Code 638543)의 효율을 확인하기 위해 CFTR 유전자에서 아래와 같은 20개 set의 primer를 사용하여 multiplex PCR을 진행하였다. Primer는 최종 PCR 산물의 크기가 70~697 bp가 되도록 디자인되었다. 이중 15 세트의 primer는 이전 연구 (Shuber et al. 1995)에서 사용되었던 primer이고 5 세트는 Primer3 tool로 새롭게 디자인했다. PCR 반응은 사람의 gDNA 10 ng을 주형으로 사용하고, 이후 PCR 산물 18 ㎕를 1x TAE 버퍼로 제작된 4% agarose gel에서 80 V로 200분간 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 확인하였다.

Target	Forward primer sequence	Reverse primer sequence	Reference
CFTR intron 19 [22]	GAA TCA TTC AGT GGG TAT AAG CAG	AGG CTT CTC AGT GAT CTG TTG	Shuber et al. 1995
CFTR exon 19 [22]	AGT CTA ACA AAG CAA GCA GTG	GCC CGA CAA ATA ACC AAG TGA	Shuber et al. 1995
CFTR exon 21 [24]	CAA AAG TAC CTG TTG CTC CA	TGA TGG TAA GTA CAT GGG TG	Shuber et al. 1995
CFTR exon 9 [10]	CCA CTG AAA ATA ATA TGA GGA AAT	CTT CTA ATG GTG ATG ACA GCC T	Shuber et al. 1995
CFTR exon 13 [14]	TAA GGG AGT CTT TTG CAC AA	AGG TAG CAG CTA TTT TTA TGG	Shuber et al. 1995
CFTR exon 4	CGA TAC AGA ATA TAT GTG CC	TGT AGG AAG TCA CCA AAG	Shuber et al. 1995
CFTR exon 17b [20]	AGT TAA TGA GTT CAT AGT ACC TGT T	GGA GTC CAA TTT TCA CTC ATC TTG	Shuber et al. 1995
CFTR exon 7 [8]	GGT ACA TTA CCT GTA TTT TGT TT	AGA TAC TTC AAT AGC TCA GCC	Shuber et al. 1995
CFTR exon 11 [12]	TAC ATG AAT GAC ATT TAC AGC A	CAG ATT GAG CAT ACT AAA AGT G	Shuber et al. 1995
CFTR exon 10 [11]	TCA CAT AGT TTC TTA CCT CT	GAG CCT TCA GAG GGT AAA AT	Shuber et al. 1995
CFTR exon 20 [23]	TCC TTT TGC TCA CCT GTG GT	AAG AAC TGG ATC AGG GAA GA	Shuber et al. 1995
CFTR exon 5	GTA TAA TTT ATA ACA ATA GTG CC	GCT GTC AAG CCG TGT TCT A	Shuber et al. 1995
CFTR exon 14b [16]	ACA ATA CAT ACA AAC ATA GTG G	TTG GTT GTG CTG TGG CTC CT	Shuber et al. 1995
CFTR exon 12 [13]	GCA TGA GCA TTA TAA GTA AGG	GAC TCT CCT TTT GGA TAC CTA	Shuber et al. 1995
CFTR exon 3	ACA AAT GAG ATC CTT ACC CC	GGC GAT GTT TTT TCT GGA GA	Shuber et al. 1995
CFTR intron 10b	CTG TCA AGG CTG TTC TCA CT	TTG CCC ATC CTA TTC TCG TG	신규 디자인된 primer
CFTR intron 6b - 526	GAT CAT CAC ACC AGA GCC TTA G	CAC TGA TCT TCC CAG CTC TC	신규 디자인된 primer
CFTR intron 6a - 572	CCA GGA CTG CTC TAT GCA TAG	GAT CCA TAA ACC AGA GTA ATG AAA GCT	신규 디자인된 primer
CFTR intron 7a - 638	CTG TCA ATA TTC ATG CAT TAG TTG CAC	GAT TGA AGT TTG TAG AAV ATG GAG CTC	신규 디자인된 primer
CFTR intron 3c	AGG GAT AGG AGA ATG GAG TAT GTA T	GTG TTA CAG TAG TTT CAA GAA TCC C	신규 디자인된 primer

표 2. Multiplex PCR에서 사용된 primer
위의 primer에는 UPS 태그 서열로 GGTTCAGT 서열이 모든 Primer의 5’-end에 추가되어 있다 (위의 서열에는 포시되어 있지 않음)

Experiment 1: testing PCR amplification uniformity
첫 실험은 각 제조사에서 안내하는 실험 조건 (표 3)으로 20-plex PCR의 증폭효율을 테스트하였다. SuperPlex Premix는 PCR 산물의 크기가 300 bp 이하인 경우 primer는 최종 농도가 300 nM이 되도록 사용되었고, PCR 산물의 크기가 300 bp 이상인 경우 primer는 최종 농도가 150 nM이 되도록 사용하였다. 또한 타사의 master mix 제품은 각 제조사에서 안내하는 primer 농도를 사용하여 실험하였다 (KAPA2G, NEB, Qiagen master mixes - 200 nM; Invitrogen 100 nM).

Lane	Premix
Step	온도	SuperPlex™ Premix	KAPA2G Fast Multiplex Mix	Invitrogen Platinum Multiplex PCR Master Mix	NEB Multiplex PCR 5X Master Mix	Qiagen Multiplex PCR Kit
Initial denaturation	95℃	2 min	3 min	2 min	1 min	15 min
Denaturation	95℃	10 sec	15 sec	30 sec	20 sec	30 sec (94℃)
Annealing	60℃	10 sec	30 sec	1 min 30 sec	1 min	1 min 30 sec
Extension	72℃	15 sec	15 sec	1 min	1 min	1 min 30 sec
# PCR cycles		30	30	30	30	35
Final extension	72℃	N/A	1 min	10 min	5 min (68℃)	10 min

표 3. 20-plex PCR 반응에 1차추천 PCR 조건
실험은 각 제조사에서 권장하는 실험 조건에 따라 테스트되었다. 또한 Qiagen Multiplex PCR Kit는 같은 조건에서 Q-solution 첨가 여부에 따라 두가지 방법으로 테스트되었다.

Experiment 2: testing PCR cycle times
두 번째 실험은 시중에 판매중인 multiplex PCR용 시약을 사용해 SuperPlex™ Premix의 PCR cycle로 (표 4) 더 짧은 반응시간에서의 20-plex PCR 효율을 확인하였다. 모든 시약에서 primer 농도는 PCR 산물의 크기가 300 bp 이하일때 최종 농도 300 nM으로, PCR 산물의 크기가 300 bp 이상일 때 최종 농도 150 nM이 되도록 사용하였다.

표 4. 실험 2에서의 SuperPlex™ Premix와 시중의 multiplex PCR용 시약을 테스트한 PCR 조건

Reference
Shuber A. P., Grondin V. J. & Klinger K. W. A simplified procedure for developing multiplex PCRs. Genome Res. 5, 488–493 (1995).