Real Time PCR - 셋업
Q1. Takara qPCR premix는 왜 pre-denature 시간이 30초인가요?
TaKaRa Ex Taq HS Polymerase는 효소의 활성화를 억제하는 Taq anti-body를 가진 효소입니다.
그러므로, pre-denature 단계는 95도에서 30초 이어야 합니다. 그러나, 간혹 circular plasmid 또는 genomic DNA의 경우 95도 30초에서의 pre-denature가 부족할 경우가 있습니다. 이러한 경우 1~2min정도 pre-denature를 시행할 수 있으나, 2분 이상 열처리는 효소의 활성을 감소시켜 증폭 효율 및 정량화에 영향을 미칠 수 있으므로, 2분이상의 pre-denature는 피해주십시오.
Q2. 제품에 premix외에 ROX dye가 들어있어요. 언제 사용하는 건가요?
Real Time PCR 과정에서 well간 검출되는 형광시그널을 보정하기 위하여 사용하는 passive dye(Reference Dye)를 사용하는 경우가 있습니다. 이러한 경우 Real Time PCR 반응에 영향을 미치지 않으며, 다른 형광과 구분하기 위하여 "ROX dye"를 reference dye로 이용하여 결과를 보정하는데, 각 기종마다 사용 가능한 ROX Dye의 아래의 표를 참조해 주십시요. Takara 제품에는 두 종류의 ROX Dye가 포함되어 있어, 어떠한 기종에도 사용가능한 제품입니다.
Q3. Takara qPCR premix 사용시 PCR condition (Thermal profile)?
Takara qPCR premix는 기본적으로 shuttle PCR 프로토콜을 권장합니다. 이 프로토콜을 먼저 시도하고 필요에 따라 PCR 조건을 최적화 해주십시오. Tm 값이 낮은 프라이머를 사용하거나, shuttle PCR이 가능하지 않은 경우 3 step PCR로 수행해 주십시오.
각 장비별 PCR 조건은 아래의 해당 장비를 참조해 주세요.
Q4. Takara qPCR premix 사용시 Melting Curve는 어떠한 조건인가요?
Intercalater으로 Real Time PCR 반응후 반응의 특이성을 확인하기 위해 Melting curve(Dissociation)를 확인하여야 하는데, 이는 각 기종별 최적의 melting curve를 작성하는 패턴이 있으므로, 별도의 조건을 입력하는 것이 아니라, 각 기종에 있는 melting curve 패턴을 그대로 이용하시면 됩니다.
Q5. 꼭 2-step(Shuttle PCR)으로 PCR을 해야하나요?
기본적으로 Real Time PCR의 경우 짧은(80~150bp) 타겟의 증폭이 이뤄지다보니, 효율적인 반응을 위해 primer annealing과 extension을 동시에 진행하는 shuttle PCR을 이용하게 됩니다. 하지만, primer의 특이적 위치 때문에 변경이 불가할 경우 특이성 증대를 위해 annealing 온도를 64도까지 올려서 반응을 해볼 수 있습니다.
또한 반응성 증대를 위해 3-step 으로 시도해 볼 수도 있습니다.
먼저 60도 30초의 extension 시간을 1분으로 증가시켜 본 후, 반응성이 개선되지 않는다면 3-step으로 전환하여 extension 시간을 늘려볼 수 있습니다.
Q6. 증폭이 안돼요
반응결과가 나오지 않을 경우 예상되는 원인으로는 다음과 같이 크게 3가지 정도로 예측해 볼 수 있습니다.
1) PCR inhibitor
2) Template 손상
3) Primer, Probe 문제
Q7. Negative에서의 반응
1) 샘플, 시약의 오염
2) Primer dimer 생성
3) gDNA 혼입(qRT-PCR의 경우)
TaKaRa Ex Taq HS Polymerase는 효소의 활성화를 억제하는 Taq anti-body를 가진 효소입니다.
그러므로, pre-denature 단계는 95도에서 30초 이어야 합니다. 그러나, 간혹 circular plasmid 또는 genomic DNA의 경우 95도 30초에서의 pre-denature가 부족할 경우가 있습니다. 이러한 경우 1~2min정도 pre-denature를 시행할 수 있으나, 2분 이상 열처리는 효소의 활성을 감소시켜 증폭 효율 및 정량화에 영향을 미칠 수 있으므로, 2분이상의 pre-denature는 피해주십시오.
Q2. 제품에 premix외에 ROX dye가 들어있어요. 언제 사용하는 건가요?
Real Time PCR 과정에서 well간 검출되는 형광시그널을 보정하기 위하여 사용하는 passive dye(Reference Dye)를 사용하는 경우가 있습니다. 이러한 경우 Real Time PCR 반응에 영향을 미치지 않으며, 다른 형광과 구분하기 위하여 "ROX dye"를 reference dye로 이용하여 결과를 보정하는데, 각 기종마다 사용 가능한 ROX Dye의 아래의 표를 참조해 주십시요. Takara 제품에는 두 종류의 ROX Dye가 포함되어 있어, 어떠한 기종에도 사용가능한 제품입니다.
Maker |
Description |
Reference Dye |
TAKARA BIO |
Thermal Cycler Dice™ Real Time System series |
Not Use |
Roche Diagnostics |
LightCycler/LightCycler 480 System |
Not use |
LightCycler 96 |
Not use |
|
Bio-Rad |
CFX96 Real-Time PCR Detection System |
Not use |
Thermo Fisher |
Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System |
Use ROX Reference Dye II |
Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System |
Use ROX Reference Dye |
|
Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System |
Use ROX Reference Dye |
|
QuantStudio |
Use ROX Reference Dye II |
|
Cepheid |
Smart Cycler System |
Not use |
Qiagen |
Rotorgene |
Not use |
Agilent |
Mx3000P |
Use ROX Reference Dye II |
- 이외 기종에 대하여는 별도로 고객센터로 문의 바랍니다.
Q3. Takara qPCR premix 사용시 PCR condition (Thermal profile)?
Takara qPCR premix는 기본적으로 shuttle PCR 프로토콜을 권장합니다. 이 프로토콜을 먼저 시도하고 필요에 따라 PCR 조건을 최적화 해주십시오. Tm 값이 낮은 프라이머를 사용하거나, shuttle PCR이 가능하지 않은 경우 3 step PCR로 수행해 주십시오.
각 장비별 PCR 조건은 아래의 해당 장비를 참조해 주세요.
Q4. Takara qPCR premix 사용시 Melting Curve는 어떠한 조건인가요?
Intercalater으로 Real Time PCR 반응후 반응의 특이성을 확인하기 위해 Melting curve(Dissociation)를 확인하여야 하는데, 이는 각 기종별 최적의 melting curve를 작성하는 패턴이 있으므로, 별도의 조건을 입력하는 것이 아니라, 각 기종에 있는 melting curve 패턴을 그대로 이용하시면 됩니다.
Q5. 꼭 2-step(Shuttle PCR)으로 PCR을 해야하나요?
기본적으로 Real Time PCR의 경우 짧은(80~150bp) 타겟의 증폭이 이뤄지다보니, 효율적인 반응을 위해 primer annealing과 extension을 동시에 진행하는 shuttle PCR을 이용하게 됩니다. 하지만, primer의 특이적 위치 때문에 변경이 불가할 경우 특이성 증대를 위해 annealing 온도를 64도까지 올려서 반응을 해볼 수 있습니다.
또한 반응성 증대를 위해 3-step 으로 시도해 볼 수도 있습니다.
먼저 60도 30초의 extension 시간을 1분으로 증가시켜 본 후, 반응성이 개선되지 않는다면 3-step으로 전환하여 extension 시간을 늘려볼 수 있습니다.
Q6. 증폭이 안돼요
반응결과가 나오지 않을 경우 예상되는 원인으로는 다음과 같이 크게 3가지 정도로 예측해 볼 수 있습니다.
1) PCR inhibitor
PCR 저해물질들은 보통 DNA 또는 RNA 추출시 PCR 저해물질들이 제거되지 않고 남아있는 경우가 많다. 이러한 PCR 저해제들은 PCR반응을 저해시켜,
궁극적으로 PCR반응이 제대로 이뤄지지 않게 되므로, DNA 또는 RNA를 새로이 추출하는 것이 가장 좋은 방법이다.
Takara MiniBest 추출 키트는 이러한 PCR 저해제들이 남지 않게 핵산을 고순도로 추출할 수 있는 추출키트이다.
MiniBest 제품 보러 가기
Takara MiniBest 추출 키트는 이러한 PCR 저해제들이 남지 않게 핵산을 고순도로 추출할 수 있는 추출키트이다.
MiniBest 제품 보러 가기
2) Template 손상
DNA 또는 RNA의 보관상태, 오염에 따라 tempplate가 degradation되었을 경우 새로이 추출하는 것이 좋다.
3) Primer, Probe 문제
잘못된 Primer 설계로 인해 PCR 반응이 이뤄지지 않는다면, Primer를 적절하게 다시 디자인하여 합성하는 것이 가장 좋다.
그러나, 디자인 방법이나 타겟 유전자의 서열을 자세히 모를 경우 primer 디자인이 쉽지 않다.
다카라에서는 미국 NCBI database RefSeq (Reference Sequence)에 등록된 human, mouse, rat, dog, bovine, chicken의 목적 유전자에 대한 특이적 primer를 설계할 수 있는 Data base를 운영하고 있다. 당사의 PCR primer 설계 노하우와 최신유전자 정보 데이터 베이스를 이용하여 exon/exon경계부위, SNP 등을 고려하여 바이오인포메틱스를 활용한 최적화를 통해 유전자 발현 정량 PCR해석을 위한 Real Time RT-PCR용 Primer 합성서비스를 온라인으로 간단히 검색, 주문할 수 있다.
PRTSS 서비스 가기
다카라에서는 미국 NCBI database RefSeq (Reference Sequence)에 등록된 human, mouse, rat, dog, bovine, chicken의 목적 유전자에 대한 특이적 primer를 설계할 수 있는 Data base를 운영하고 있다. 당사의 PCR primer 설계 노하우와 최신유전자 정보 데이터 베이스를 이용하여 exon/exon경계부위, SNP 등을 고려하여 바이오인포메틱스를 활용한 최적화를 통해 유전자 발현 정량 PCR해석을 위한 Real Time RT-PCR용 Primer 합성서비스를 온라인으로 간단히 검색, 주문할 수 있다.
PRTSS 서비스 가기
Q7. Negative에서의 반응
1) 샘플, 시약의 오염
샘플 또는 시약의 오염으로 인해 NTC 등에서 반응이 일어날 경우, 사용하고 있는 샘플,시약을 모두 새것으로 바꾼 후 실험하는 것이 좋다.
또한, PCR 반응을 준비하는 장소 등에 대해서도 눈에 보이지 않는 DNA 또는 RNase가 있어서 지속적인 오염이 될 수 있으므로, PCR 반응 준비장소, pippet과 같은 도구 등에 대해서 오염을 제거할 수 있는 아래의 시약을 이용하여 cleaning해주는 것이 좋다.
DNA-OFF
RNase-OFF
또한, PCR 반응을 준비하는 장소 등에 대해서도 눈에 보이지 않는 DNA 또는 RNase가 있어서 지속적인 오염이 될 수 있으므로, PCR 반응 준비장소, pippet과 같은 도구 등에 대해서 오염을 제거할 수 있는 아래의 시약을 이용하여 cleaning해주는 것이 좋다.
DNA-OFF
RNase-OFF
2) Primer dimer 생성
Primer의 문제로 dimer가 지속적으로 생성될 경우 primer를 다시 디자인하는 것이 가장 좋으나, 타겟 유전자 특성상 primer 디자인이
쉽지 않은 경우 다음의 제품을 이용하여 primer dimer를 제거 또는 감소시킬 수 있다.
TB Green™ Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time) RR091A/B
위의 DimerEraser 제품은 Intercalator 검출 Assay에서 문제가 되는 프라이머 dimer 억제에 효과적인 제품으로 3 step PCR을 표준 프로토콜로 권장하기 때문에 기존 제품보다 반응시간이 더 필요하지만, 비특이적 증폭을 억제하여 미량의 주형까지 고감도로 검출할 수 있다.
TB Green™ Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time) RR091A/B
위의 DimerEraser 제품은 Intercalator 검출 Assay에서 문제가 되는 프라이머 dimer 억제에 효과적인 제품으로 3 step PCR을 표준 프로토콜로 권장하기 때문에 기존 제품보다 반응시간이 더 필요하지만, 비특이적 증폭을 억제하여 미량의 주형까지 고감도로 검출할 수 있다.
3) gDNA 혼입(qRT-PCR의 경우)
cDNA를 이용한 qPCR시 NTC에서 반응결과가 나올 경우, gDNA의 혼입을 예상해 볼 수 있다. RNA 추출 단계 또는 RT단계에서 DNase I 을 처리를 하지 않아 발생하는 문제이다.
이러한 gDNA의 혼입에 따라, Ct가 빨라지는 경우가 있으나, 이는 타겟 유전자의 결과만이 아니기 때문에 좋은 결과라 판단하는 경우 향후 결과 해석에서 문제가 될 수 있다.
그러므로, 정확한 정량 해석을 위해서는 gDNA를 제거하는 DNase I 처리를 하는 것이 좋다.
다카라에는 별도의 RT과정에서의 DNase I 처리를 포함시켜, 손쉽게 gDNA를 제거할 수 있는 RT Kit가 최근 많은 유저들에게 각광을 받고 있다.
PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)
해당 제품은 사용후에 유저들의 만족도가 높아 재구매율이 증가하는 제품이다.
이러한 gDNA의 혼입에 따라, Ct가 빨라지는 경우가 있으나, 이는 타겟 유전자의 결과만이 아니기 때문에 좋은 결과라 판단하는 경우 향후 결과 해석에서 문제가 될 수 있다.
그러므로, 정확한 정량 해석을 위해서는 gDNA를 제거하는 DNase I 처리를 하는 것이 좋다.
다카라에는 별도의 RT과정에서의 DNase I 처리를 포함시켜, 손쉽게 gDNA를 제거할 수 있는 RT Kit가 최근 많은 유저들에게 각광을 받고 있다.
PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)
해당 제품은 사용후에 유저들의 만족도가 높아 재구매율이 증가하는 제품이다.