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Real Time PCR - 시약 사용

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Q1. 제품은 동결보존이지만, 동결융해를 반복해도 괜찮은가요?
10회의 동결융해에서는 성능에 영향이 없다고 확인되었습니다. 그 이상의 동결융해를 할 경우에는 최초 융해 시에 분주하여 보관해주세요.

Q2. Hot start PCR용 효소에 대해 최초의 활성화 단계는 필요하지 않은가요?
제품에 사용되는 TaKaRa Ex Taq® HS는 polymerase 활성을 억제하는 anti-Taq 항체를 이용하는 Hot start PCR용 효소입니다.
타사의 화학식 타입의 Hot start PCR 효소에서 요구되는 PCR 반응 전의 95℃, 5~15분의 활성화 단계(denaturation)는 필요하지 않습니다. 오히려 권장 시간 이상 (일반적으로 30초, gDNA 또는 circular DNA의 증폭시 최대 2분)의 열처리를 가하면 효소활성이 저하되어 증폭효율 및 정량 정밀도가 감소하게 됩니다.

Q3. RT-PCR에서 cDNA(RT 반응액)을 주형으로 첨가할 경우, 얼마까지 첨가 가능한가요?
PCR 반응 용량의 10% 이하 (25 ㎕ 반응의 경우는 2.5 ㎕까지)로 사용하세요.
Real time RT-PCR을 실시할 경우는 TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Code RR820A) 과 역전사 반응 시약이 세트로 되어 있는 One Step TB Green™ PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR096A)를 사용을 권장합니다.

Q4. 제품을 용해했는데 침전물이 있습니다. 사용해도 괜찮은가요?
손으로 따뜻하게 해주거나 차광하여 실온에 잠시 둔 후 부드럽게 섞으면, 침전물은 제거 됩니다. 침전물이 용해되면 성능상에 전혀 문제가 없습니다. 심한 vortex의 사용은 피하시기 바랍니다.

Q5. 지금까지 3-step PCR을 해왔는데, 이 시약을 사용할 경우는 2-step PCR로 바꾸는 것이 좋은가요?
당사 시약의 경우, 표준 프로토콜로 Shuttle PCR (2-step PCR)을 권하고 있으므로, 먼저 2-step PCR을 이용하시기 바랍니다. Annealing/Extension 온도는 일반적으로 60℃를 권장하고 있지만, 최적화를 위해 60~66℃의 범위에서 검토를 권장합니다. Annealing/Extension 온도를 68℃로 설정하면 primer binding이 불완전하여 증폭 효율이 저하될 경우가 있으므로 주의하세요. Shuttle PCR에서 반응성이 나쁠 경우, 3-step PCR로 변경해 보시기 바랍니다. Real time PCR을 효율적으로 실시하기 위해서는 반응성이 좋은 primer를 설계하는 것이 중요합니다. Cycling 조건을 변경해도 좋은 결과를 얻지 못한 경우는 primer를 새롭게 design 할 것을 권장합니다.

Q6. 제품에 첨가되어 있는 ROX Reference Dye나 ROX Reference Dye Ⅱ는 어디에 사용하는가요?
Applied Biosystems사의 Real time PCR 장치(ABI PRISM 7000/7700/7900HT, Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System)을 사용할 경우에 well 간 보정용 dye로 사용합니다. 반응액에 1/50 양을 첨가하여 사용하세요. 7500 Real-Time PCR System에는 ROX Reference Dye Ⅱ를, ABI PRISM 7000 등에는 ROX Reference Dye를 사용하세요. Smart Cycler System이나 LightCycler를 사용할 경우는 필요하지 않습니다.