RNA-seq의 강점을 활용한 뇌세포 유형 특성화 DATE: October 22, 2018

Out of many, one: the brain as a heterogeneous whole
우리 은하에 있는 별의 수만큼 (약 1,000억개) 뇌세포가 있고, 각 세포는 고유한 전사적 시그니처 (transcriptional signature)에 의해 각자의 기능을 한다. 그러나 기존에 진행하던 세포 전체 (bulk) RNA-seq 실험에서는 이러한 전사적 시그니처를 구분할 수 없어 질병에서 유전자 발현 차이를 유발할 수 있는 특정 세포 유형을 가려낼 수 없었다.

이러한 문제를 해결하기 위해 Allen Institute for Brain Science (AIBS)는 SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing*을 사용하여 인간 뇌 조직에서 파생된 단일 핵에서 전사 데이터를 생성하기 위한 간단한 실험 방법을 개발하였다 (자세한 내용은 straightforward workflow 참조).
* SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing은 SMART-Seq^® mRNA, SMART-Seq^® mRNA LP로 리뉴얼 되었습니다.

Separation anxiety: isolating and labeling single nuclei from human brain
사후 인간 뇌 조직으로 작업하는 데는 몇 가지 문제가 있으며, 특히 샘플의 품질을 유지하기 위해 인간 뇌 조직을 신속하게 보존 (일반적으로 급속동결) 해야 한다. 사후 인간 뇌에서 손상되지 않은 세포를 분리하는 것과 급속 동결하는 작업의 비호환성으로 인해 AIBS 연구원은 피질 (중측두회, middle temporal gyrus; MTG) 및 가쪽무릎핵 (lateral geniculate nucleus; LGN) 인간 뇌 조직 샘플에서 핵 샘플을 만들었다.
그런 다음 핵을 신경 세포 및 그 핵에 특이적인 핵 enriched marker인 NeuN과 DAPI에 대한 PE-conjugated 항체로 염색하였다. 단일 핵은 DAPI 및 PE (NeuN) 신호를 사용하여 FACS로 분리하였다.



We go to 11: sequencing of SMART-Seq v4 amplified libraries
AIBS는 단일 핵 (nuclei) 안에 존재하는 적은 양의 샘플을 분석하기 위해 하나의 세포에 들어있는 10 pg 수준의total RNA를 높은 감도로 분석한 적용 예가 있는 당사의 SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing를 사용하여 library 준비 전에 RNA를 증폭하였다. SMART-Seq v4로 증폭한 다음 1,576 LGN와 15,928 MTG의 library를 구성하여 1천만 reads로 sequencing 하였다. 본 library는 read의 평균 87%가 성공적으로 정렬 (aligning)되고, read 중 평균 28.3% 및 38.5%가 각각 엑손과 인트론에 매핑되며 QC metrics를 통과하였다.

그런 다음, 주성분 분석 (principal component analyse) 과 초근접 이웃 탐색 (nearest-neighbor analysis) (Bakken et al. 2017)을 사용하여 핵을 클러스터링 하고, 마커 유전자 발현을 기반으로 광범위한 세포 유형 (GABAergic interneuron, glutamatergic neuron, astrocyte, microglia 등)으로 분류하였다. 개별 클러스터에 가장 특이적인 유전자를 보완하는 방법으로 하나 이상의 클러스터를 포함하는 넓은 세포 유형은 더 세분화하였다. 클러스터별 시퀀싱 메트릭 요약은 AIBS 프로토콜의 표 9 및 11에서 확인할 수 있다.

It pays to be smart: robust and sensitive amplification of ultra-low-input samples
시퀀싱을 위해 단일 세포 및 핵으로 작업하는 것은 매우 작은 RNA input 양으로 인해 매우 큰 도전이지만, 이러한 샘플 유형은 조직 수준에서 세포 수준으로 유전자 발현 프로파일링을 바꿀 수 있어 그 중요성이 커질 것이다.
단일 세포 및 단일 핵으로부터 RNA-seq 라이브러리를 제작하기 위한 올바른 방법을 선택하는 것은 신뢰도 높은 데이터를 생성하는 데에 중요하며, 본 연구에서는 시퀀싱용 SMART-Seq v4 Ultra Low Input Kit의 감도와 이점을 확인할 수 있다.

[원문] Using the power of RNA-seq to characterize brain cell types

■ References
Bakken, T. E. et al. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv 239749, doi:10.1101/239749 (2017).