• 간편한 정제과정: 최적화된 프로토콜로 freeze-thaw 및 ultracentrifugation 불필요
• 신뢰할 수 있는 데이터를 위한 고순도 정제 실현: 정제된 AAV는 in vivo 실험에 최적
• Serotype에 관계없이 정제 가능

■ Introduction
Adeno-associated virus (AAV) vector는 낮은 병원성, 바이러스의 지속성 및 여러 가지 AAV serotype으로 특정 세포와 조직을 표적할 수 있는 능력을 포함한 다양한 기능 덕분에 gene therapy 연구에 매우 효과적인 유전자 전달 도구임이 입증되었다. (Buning 2019). 이러한 광범위한 잠재력이 발휘되기 위해서는 AAV vector를 고순도로 정제해야 한다. 그러나 현재 사용 가능한 많은 정제법은 serotype에 따라 효율이 달라 각 벡터에 대한 별도의 정제방법 개발 및 최적화가 필요하다. Takara AAVpro ‘All Serotypes’ 키트는 모든 serotype의 AAV를 정제할 수 있도록 간편한 침전 및 여과 방법을 사용하여 이러한 한계를 극복할 수 있다.

그림1. AAVpro^® Purification Kit Maxi (All Serotypes) 제품을 사용한 간단하고 효율적인 AAV 정제.
AAVpro Purification Kit Midi (All Serotypes)의 정제 프로토콜은 Millex-HV 0.45-μm 필터 대신 Amicon Ultra-4 필터가 사용된다는 점 외에는 상기 방법과 동일하다. Midi 및 Maxi 키트는 모든 serotype에서 AAV 를 정제할 수 있고, Maxi 키트는 5 x T225 flask 용량의 배양세포에서, Midi 키트는 1 x T225 flask (또는 10 cm dish 4개)에서 AAV를 정제할 수 있다.

■ Results
High purity for each AAV serotype
정제 키트의 순도를 확인하기 위해 AAVpro^® Purification Kit Maxi (All Serotypes)를 사용하여 producing cell로부터 형광단백질 ZsGreen1을 발현하는 각 serotype의 AAV (AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6)를 정제하였다. 바이러스 genome 서열을 Real Time PCR로 분석하여 바이러스 역가를 확인하고, SDS-PAGE를 통해 모든 AAV serotype에 존재하는 AAV capsid 단백질 (VP1, VP2, VP3)을 확인하여 정제된 AAV의 순도를 체크하였다.

그림 2. AAVpro^® Purification Kit Maxi (All Serotypes)를 사용하여 정제한 AAV의 순도.
각각 형광단백질 ZsGreen1을 포함하는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6을 제품 매뉴얼에 따라 T225 flask 5개에서 배양된 producing cell에서 정제하였다. 바이러스 역가는 AAVpro^® Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2 (Code 6233)를 사용하여 측정하였고, SDS-PAGE는 1 x 109 vector genome/lane을 로딩하였다.

Infectivity of purified AAV particles
위에서 정제된 AAV 샘플을 세 가지 다른 세포주 CHO, RD, HT1080에 감염시켜 3일 후 flow cytometry로 감염성을 평가하였다. 그 결과, 본 제품을 사용하여 정제된 AAV가 모든 세포주를 감염시켰음을 확인할 수 있었다.

그림 3. AAVpro^® Purification Kit Maxi (All Serotypes)으로 정제된 AAV의 감염성.
형광단백질 ZsGreen1을 발현하는 AAV는 3종 세포에 각각 세포당 5,000 vector genome (AAV1, 2, 3, 6) 또는 세포당 50,000 vector genome (AAV5)로 감염시킨 다음, 3일 후 flow cytometry로 분석하였다.

Infection of iPSC-derived cardiomyocytes
추가 실험으로 키트로 정제한 AAV를 iPSC 유래 심근세포에 테스트하였다. AAVpro^® Purification Kit Midi (All Serotypes) 키트로 형광단백질 ZsGreen1을 발현하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6를 producing cell로부터 정제하여 위의 방법과 같이 바이러스 역가를 측정한 후, iPSC 유래 심근세포에 감염시켰다. AAV serotype에 따라 감염 효율의 차이가 있었지만 (AAV 6, 2, 1이 AAV5보다 효과적으로 감염됨), 결과적으로 정제된 AAV가 실제 이러한 iPSC 유래 심근세포를 효과적으로 감염시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

추가 실험으로 키트로 정제한 AAV를 iPSC 유래 심근세포에 테스트하였다. AAVpro^® Purification Kit Midi (All Serotypes) 키트로 형광단백질 ZsGreen1을 발현하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6를 producing cell로부터 정제하여 위의 방법과 같이 바이러스 역가를 측정한 후, iPSC 유래 심근세포에 감염시켰다. AAV serotype에 따라 감염 효율의 차이가 있었지만 (AAV 6, 2, 1이 AAV5보다 효과적으로 감염됨), 결과적으로 정제된 AAV가 실제 이러한 iPSC 유래 심근세포를 효과적으로 감염시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 그림 4. iPSC 유래 심근세포로의 유전자 도입.
5개의 T225 플라스크에서 배양한 AAV producing cell로부터 AAVpro^® Purification Kit Midi (All Serotypes)를 이용하여 형광단백질 ZsGreen1을 발현하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6를 정제하였다.
정제된 각 AAV는 세포당 500,000 vector genome으로 iPSC 유래 심근세포에 transduction 하고, 72시간 후 현미경으로 ZsGreen1 형광을 관찰하였다 (노출시간: AAV5는 0.5초, 그 외는 0.2초). NC = negative control

Conclusion
AAVpro^® Purification Kit (All Serotypes)는 단 4시간 안에 AAV serotype에 관계없이 AAV를 높은 순도와 회수율로 정제할 수 있다. 또한 최적화된 프로토콜로 기존에 세포 파쇄와 정제과정에 각각 사용되었던 freeze-thaw와 ultracentrifugation 과정을 필요로 하지 않는다. 마우스 뇌에 직접 AAV를 주입하는 것을 포함한 다양한 in vivo 실험에 이러한 ‘all serotype’ 키트를 사용한 예를 아래의 논문에서 확인할 수 있다.

■ Methods
Purity and infectivity of purified AAV particles
5개의 T225 플라스크에서 배양한 AAV 생산 세포로부터 AAVpro^® Purification Kit Maxi (All Serotypes) 제품의 매뉴얼에 따라 형광단백질 ZsGreen1을 발현하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6를 정제하였다.
바이러스 역가는 AAVpro^® Titration Kit (for Real Time PCR)로 측정하고, 레인 당 1 x 109 vector genome으로 각 샘플을 SDS-PAGE에 로딩하였다.
정제된 AAV는 세 가지 세포주 (CHO, RD, HT1080)에 5,000 vector genome/cell (AAV1, 2, 3, 6), 50,000 vector genome/cell (AAV5) 농도로 감염시킨 후 3일 뒤에 flow cytometry로 분석하였다.

Infection of iPSC-derived cardiomyocytes
5개의 T225 플라스크에서 배양한 AAV producing cell로부터 AAVpro^® Purification Kit Midi (All Serotypes) 제품의 매뉴얼에 따라 형광단백질 ZsGreen1을 발현하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6를 정제하였다. 정제된 AAV는 iPSC 유래 심근세포에 500,000 vector genome/cell 농도로 감염시킨 다음 72시간 후에 현미경으로 ZsGreen1 형광을 관찰하였다 (노출시간: AAV5는 0.5초, 그 외는 0.2초). NC = negative control

■ References & citations
References
Buning, H. and Srivastava, A. Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 12, 248-265 (2019).
Selected product citations
Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature 576, 287-292 (2019).
Hashimoto, M. CREG1 stimulates brown adipocyte formation and ameliorates diet-induced obesity in mice. FASEB J. 33, 8,069-8,082 (2019).
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Li, H. Gene suppressing therapy for Pelizaeus-Merzbacher disease using artificial microRNA. JCI Insight. 4, 125052 (2019).
Miyawaki, T., et al. Visualization and molecular characterization of whole-brain vascular networks with capillary resolution. Nat. Commun. 11, 1,104 (2020).
Tomono, T., et al., Infectivity assessment of recombinant adeno-associated virus and wild-type adeno-associated virus exposed to various diluents and environmental conditions. Hum. Gene Ther. Methods. 30, 137-143 (2019).
Zhong, G., et al. A reversible RNA on-switch that controls gene expression of AAV-delivered therapeutics in vivo. Nat. Biotechnol. 38, 169-175 (2020).