Q1. Lenti-X™ GoStix™ Plus (Code 631280 외)를 사용하면 렌티바이러스 역가를 측정할 때 어떤 점이 좋은가요?
Lenti-X™ GoStix™ Plus (Code 631280외) 카세트는 빠르고 심플한 방법으로 정확하게 역가 측정이 가능합니다. qPCR, ELISA, functional assay 같은 전통적인 역가측정 방법은 기간이 상당히 오래 걸리고 번거롭습니다. 따라서 샘플이 많거나, 바이러스를 회수하기 위한 적절한 타이밍을 결정하는 실험에는 적합하지 않을 수 있습니다. Lenti-X™ GoStix™ Plus는 카세트에 바이러스 상층액 20 ㎕를 첨가한 후, 스마트폰 카메라로 카세트를 스캔하여 10분만에 역가를 측정할 수 있으므로 바이러스 회수 타이밍을 결정하는 용도로 적합합니다. 아래는 Lenti-X™ GoStix™ Plus로 렌티바이러스 역가를 측정하는데 걸리는 시간과 다른 기존의 방법들과 비교한 결과입니다.

그림 1. 가장 일반적으로 사용되는 렌티바이러스 역가 측정 방법들의 시간을 측정하였음.
Lenti-X™ GoStix™ Plus (Code 631280외) : 상등액에서 렌티바이러스 p24 검출을 위한 lateral flow 기반 방법, qRT-PCR : qRT-PCR로 바이러스 RNA genome을 정량, ELISA : ELISA로 p24 capsid protein을 정량, PCR : qPCR 방법으로 gDNA에 인테그레이션된 DNA provirus를 검출, IFU (FACS) : REP/GFP positive cell의 FACS 분석을 통해 감염된 세포의 비율을 결정,  IFU (Selection): transduced population에서 drug resistant colony수를 정량

Q2. p24가 무엇인가요?
연구용으로 생성된 재조합 렌티바이러스에는 envelope proteins, matrix proteins, virus core protein등과 같은 바이러스를 구성하는 주요 단백질이 포함되어 있습니다 (그림 2). p24는 렌티바이러스 입자의 capsid (껍질) 대부분을 구성하는 구조 단백질이며, nucleocapsid protein인 p6, p7, matrix protein인 p17과 함께 gag 유전자에 의해 암호화됩니다.
Lenti-X™ GoStix™ Plus, p24 ELISA와 같은 방법은 p24의 양이 감염성 바이러스 역가와 직접적으로 연관된다는 사실을 이용하여 렌티바이러스 상등액에 존재하는 p24 capsid protein 양을 측정하도록 디자인되었습니다.

그림 2. 렌티바이러스의 capsid를 구성하는 주요 구조 단백질인 p24

Q3. GoStix™ Value (GV) 역가는 무엇인가요?
GoStix™ Plus 어플은 GoStix™ 카세트에서 test (T)와 control (C) 밴드의 강도를 측정합니다 (그림 3). 그 후, GoStix Value (GV; ng/㎖ p24와 동일)라는 단위를 생성하는 계산을 수행합니다. 카세트에 있는 test 밴드의 강도는 렌티바이러스 상등액에 있는 p24 단백질의 양에 따라 증가하며, 이는 infectious units (IFU)의 증가와 관련이 있습니다. 기존의 p24 ELISA 또는 qRT-PCR 방법으로 각각 역가를 측정할 때, ng p24 또는 genome copy (gc)가 감염 역가와 관련이 있듯이, GV도 감염 역가와 관련이 있습니다 (그림 4-6, 후속 질문 참조).
다른 분석과 같이 각 실험에 가장 적적할 GV는 타겟 세포, 필요한 MOI, 사용된 렌티바이러스 벡터 및 패키징 시스템을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다.

그림 3. 스마트폰 카메라를 사용하여 test (T)와 control (C) 밴드의 상대적인 강도를 측정하고, 밴드 비율을 계산하여 역가를 계산하는 GoStix™ Plus 어플

Q4. GV 역가는 infectious units (IFU)와 얼마나 정확하게 일치합니까?
그림 4, 5 (아래)에 제시된 데이터에서 볼 수 있듯이, 다양한 농도의 샘플과 다양한 렌티바이러스 패키징 시스템에서 생산된 바이러스의 GV와 IFU 값은 높은 상관관계를 갖습니다.

그림 4. 다양한 농도에서 transduction titer (IFU) 값과 높은 상관관계를 가지는 Lenti-X™ GoStix™ Plus로 측정한 역가
ZsGreen1-렌티바이러스를 Lenti-X™ Packaging Single Shots (패키징 시스템)으로 제작하여serial dilution 후, Lenti-X™ GoStix™ Plus로 농도를 측정하였습니다. 또한 실제 IFU/㎖ 값을 구하기 위해 각각의 희석액을 HT1080 세포에 transduction하여 역가측정을 하였습니다. 같은 패키징 시스템에서 생산하여 같은 시기에 회수한 reference virus의 GV : IFU/㎖ 비율을 이용하여 미지 샘플의 IFU/㎖을 계산했습니다. 이를 통해 Lenti-X™ GoStix™ Plus에서 측정된 IFU/㎖와 실제 IFU/㎖를 그래프로 나타냈습니다.


그림 5. 다양한 패키징 시스템에서 측정한 transduction 역가와 높은 상관관계를 가지는 Lenti-X™ GoStix™ Plus로 측정한 역가
ZsGreen1-렌티바이러스는 3개의 상용화된 렌티바이러스 벡터 및 패키징 시스템을 사용하여 생산되었습니다. 그리고 이 3개의 샘플을 희석하여 Lenti-X™ GoStix™ Plus로 분석하였습니다. 같은 패키징 시스템에서 생산하여 같은 시기에 회수한 reference virus의 GV : IFU/㎖ 비율을 이용하여 미지 샘플의 IFU/㎖을 계산했습니다. 이를 통해 Lenti-X™ GoStix™ Plus에서 측정된 IFU/㎖와 실제 IFU/㎖를 그래프로 나타냈습니다.

Q5. 어플은 어디서 다운로드할 수 있나요?
App Store 또는 Google Play에서 “GoStix Plus"를 검색하시면 어플을 다운로드할 수 있습니다.

Q6. GoStix™ Plus 어플이 지원되는 기종은 무엇인가요?
이 어플은 iOS 9 운영 체제 이상을 사용하는 v6 이후의 모든 Apple iPhone과 Apple iPod Touch 6 이상에서 작동합니다. 그리고 Android v6이상의 Android 스마트폰에서 사용할 수 있습니다.

참고 : GoStix™ Plus 어플은 태블릿에서 테스트되지 않았습니다.

Q7. GV값은 IFU/㎖ 또는 ng p24 값과 어느정도 상관관계가 있나요?
두 값은 간단하게 비교할 수 있습니다. 아래 제시된 데이터는 ELISA와 Lenti-X GoStix Plus 기반 역가를 비교한 자료입니다.


그림 6. ELISA 기반 역가측정과 유사한 방식으로 사용할 수 있는 Lenti-X™ GoStix™ Plus 기반 역가측정
패널 A. Lenti-X™ ZsGreen1 렌티바이러스는 Lenti-X™ Packaging Single Shots (패키징 시스템)을 이용하여 생산되었습니다. 이후 transduction된 세포 비율 (% transduced)은 FACS 분석을 통해 HT1080 세포에서 측정되고, Lenti-X p24™ Rapid Titer Kit (ELISA) 및 Lenti-X™ GoStix Plus를 사용하여 lentiviral p24 수준을 측정하였습니다. Transduction은 다양한 MOI에서 HT1080 세포에서 수행되었으며, 이후 transduction 효율을 관련 ELISA 및 GoStix Values (ng/㎖ p24)에 대해 그래프화 하였습니다. 패널 B. Transducion 된 세포의 형광 이미지는 transduction 48시간 후 촬영하였습니다.

Q8. GoStix™ 역가에 영향을 미칠 수 있는 요소는 무엇입니까?
서로 다른 실험 간의 역가를 비교하기 위해 Lenti-X™ GoStix Plus (또는 p24 ELISA나 qRT-PCR 등)를 이용할 때는 렌티바이러스 패키징 시스템, 렌티바이러스 벡터, transfection 방법, 바이러스 회수 시간, 스캐닝 기기와 같은 변수가 일정해야 합니다. 이러한 매개 변수가 실험 중 변경되면 GV를 IFU로 변환하기 위한 상관계수를 다시 계산해야 합니다.

Q9. 바이러스 회수 시기가 GoStix™ Value에 어떤 영향을 줄 수 있나요?
GoStix™ Value (GV)는 생성된 p24 단백질 양에 비례하며, 이는 회수 시간에 영향을 받습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 매개변수 (예: 패키징 시스템, transfection 방법 등)가 일정하게 유지된다고 가정했을 때, 회수 시간이 길어질수록 GV (ng/㎖ p24)가 커집니다. 또한 그림 7에서 GV와 IFU/㎖ 간의 비율이 회수 시간에 따라 달라지는 것을 볼 수 있습니다. 따라서 GV를 IFU/ml로 변환하고, 다른 실험과 비교하기 위해서는 회수 시간을 일정하게 유지해야 합니다.

그림 7. 회수 시간에 따라 달라지는 p24 생산 및 GoStix™ Value. ZsGreen1-렌티바이러스 제작은 Lenti-X™ Single Shots을 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 duplicate로 진행되었으며, 표시된 시간에 회수하였습니다.
회수 후, Lenti-X™ GoStix™ Plus을 통해 샘플의 GV (ng/㎖ p24)를 측정하였고, 각 시점의 바이러스 희석액의 IFU/㎖은 HT1080 세포를 이용하여 측정하였습니다.

Q10. GoStix™에 시그널이 나타날 때까지 10분을 기다리지 않으면 어떻게 되나요?
일관된 테스트 결과를 얻기 위해 권장 시간을 준수해야합니다. 그렇지 않으면 이전에 테스트한 샘플과 결과를 정확하게 비교할 수 없습니다. 타이머에서 10분이 경과하기 전에 Skip 버튼을 누르면 어플 내에 경고가 표시됩니다.

Q11. 스마트폰이 없어도 Lenti-X™ GoStix™ Plus를 사용할 수 있나요?
네, 하지만 스마트폰 어플에서 밴드의 강도를 스캔해야 정량적 역가를 측정할 수 있습니다. 그렇지 않으면 정성적 역가만 확인이 가능합니다.

그림 8. Lenti-X™ GoStix™ Plus를 사용하여 정성적 결과 확인. 검출 가능한 역가의 렌티바이러스가 있을 때 테스트 밴드가 표시되므로 스마트폰 스캔 없이도 정성적인 역가 확인이 가능합니다. 위 실험에서 ~5 x 10⁵ IFU/㎖ (transduction된 HT-1080 세포를 유세포분석법으로 측정)를 포함하는 희석액에 의해 뚜렷한 밴드가 생성되었습니다.

Q12. Lenti-X™ GoStix™ Plus는 왜 표준곡선을 그릴 필요가 없나요?
p24 ELISA 및 pRT-PCR 분석과 같이 일반적으로 사용되는 다른 역가 측정 키트는 항상 표준곡선을 생성하여 테스트 샘플을 비교해야 합니다. 하지만 Lenti-X™ GoStix™ Plus는 인터넷이 연결된 상태에서 어플을 실행하면 Takara Bio USA, Inc.에서 제공하는 각 lot에 대한 표준 곡선을 자동으로 불러올 수 있어, 따로 표준 곡선을 그릴 필요가 없습니다. 따라서 시간과 비용을 절약할 수 있고, lot과 실험 간의 GV 측정값에서 최상의 정확도를 제공합니다.

Q13. 어플에서 사용한 키트의 lot 번호를 입력해야 하는 이유는 무엇인가요? 그리고 lot 번호는 어디에서 찾을 수 있나요?
ELISA와 같이 Lenti-X™ GoStix™ Plus도 lot 마다 표준곡선이 조금씩 다르기 때문에 정확한 데이터를 도출하기 위해 어플에 lot 번호를 입력해야 합니다. Lot 번호는 GoStix 카세트 파우치에 있는 QR 코드를 스캔하여 입력하거나 수동으로 입력할 수 있습니다 (그림 9).

그림 9. 키트의 lot 번호는 수동으로 입력하거나 패키지의 QR 코드를 스캔하여 입력.

Q14. 스마트폰은 인터넷이 연결되어야 하나요?
어플을 처음 사용할 때, 사용하는 키트의 표준곡선을 어플에 다운로드 받기 위해 인터넷에 연결해야 합니다. 어플은 lot별 표준곡선을 사용하여 GV를 계산합니다. 따라서 새로운 lot 번호를 갖는 GoStix을 사용할 때는 lot번호에 맞는 표준곡선을 새로 다운로드 받기 위해 인터넷 재연결이 필요합니다.

Q15. 역가가 GoStix™ 범위를 벗어나는지 어떻게 알 수 있나요?
정확한 결과를 위해서 테스트 밴드의 강도가 컨트롤 밴드의 강도보다 낮아야 합니다. 이 비율이 1에 가까울수록 샘플이 표준곡선을 초과하는 것입니다. 비율이 1에 가깝다면 샘플을 1:2로 희석하고 희석액을 새 카세트에 로딩한 후, 아래 스크린샷의 녹색 화살표와 같이 스캔할 때 어플에 희석 계수를 선택합니다.


Q16. 어플에 데이터를 저장할 수 있나요?
네, 어플을 삭제하지 않는 한, 결과는 “결과 기록” 보기 (메인 메뉴에서 엑세스 가능)에 저장됩니다. 데이터 손실을 방지하려면 아래 첫 번째 스크린샷의 녹색 화살표로 표시된 대로 각 데이터 세트 페이지 하단의 [Share] 버튼을 눌러 데이터를 이메일로 보내는 것이 좋습니다. 아래 두 번째 스크린샷에서 녹색 화살표로 표시된 것처럼 "결과 기록"의 오른쪽 상단 부분에 있는 [모두 다운로드] 버튼을 눌러 모든 데이터를 모바일 기기에 다운로드할 수도 있습니다. 다운로드한 데이터를 불러오는 방법은 다음 문항에서 볼 수 있습니다.


Q17. 내 모바일 기기에 다운로드한 결과 데이터를 찾으려면 어떻게 해야하나요?
기기에 데이터를 다운로드한 후 데이터를 검색하려면 아래에 제공된 iOS 또는 Android 관련 지침을 따르세요.

Mac 컴퓨터를 사용하는 iOS 모바일 기기
1. iPhone을 Mac 컴퓨터로 연결
2. Finder window 열기
3. 왼쪽 탐색 메뉴의 “Locations”에서 모바일 기기를 선택합니다.
4. 파일을 선택합니다.
5. GoStix Plus app의 row list 확장
6. “Download” 폴더를 원하는 위치에 복사
7. 다운로드한 데이터가 포함된 .csv 파일은 지정된 위치의 “Download” 폴더에서 검색할 수 있습니다.

Windows 컴퓨터 (iTunes 포함)를 사용하는 iOS 모바일 기기
1. iPhone을 Windows 컴퓨터에 연결
2. iTunes을 실행
3. window 창의 상단 모서리에 있는 iTunes toolbar에서 전화 아이콘 선택
4. 왼쪽 탐색 메뉴에서 "File Sharing" 선택
5. list에서 GoStix Plus app 선택
6. "Download" 폴더를 선택한 다음 [Save]를 클릭하고 destination을 지정
7. 다운로드한 데이터가 포함된 .csv 파일은 지정된 위치의 “Download” 폴더에서 검색할 수 있습니다.

Android 모바일 기기
1. 모바일 기기에서 파일 탐색기 app을 실행
2. "Downloads"를 선택
3. 다운로드한 데이터가 포함된 .csv 파일을 사용할 수 있습니다.

Q18. 영어 이외의 언어로 GoStix Plus 어플을 사용할 수 있습니까?
네, 모바일 기기의 언어 설정에 따라 GoStix Plus어플은 영어, 일본어, 중국어, 한국어를 지원합니다. 기기 설정과 상관없이 어플에서 영어로 텍스트를 표시하도록 하려면 "메뉴" 페이지로 이동하여 [언어 재선택]을 선택하세요.
결과 데이터가 포함된 output .csv 파일에서 영어 이외의 언어에 대한 문자를 제대로 표시하려면 Excel에서 UTR-8 인코딩을 선택합니다.