Co-transcriptional capping은 IVT (in vitro transcription) 반응 시 cap analog를 넣어서 mRNA가 합성되는 동시에 5’ 말단에 cap analog가 끼어들어가도록 하는 방법이다. 이를 위해 cap analog에 호환되는 각각의 transcription start site가 template plasmid에 필요하다. 현재 시장의 메인이 되는 co-transcriptional capping 기술은 CleanCap^® (TriLink BioTechnologies)와 ARCA (Anti-reverse cap analog)이고, 모두 Takara IVTpro™ 시리즈와 같이 사용할 수 있다.

■ 각 capping 기술 요약
CleanCap^®과 ARCA (Anti-reverse cap analog) 방법은 각각 장단점이 있다. 이는 연구자의 필요에 따라 선택하여 사용할 수 있다.

CleanCap^®은 가장 최신 세대의 cap analog로 cap-1 구조의 mRNA를 단일 step으로 합성할 수 있다. 그러나 상대적으로 고가이고, 특허 및 라이선싱을 고려해야 한다. 반면, ARCA는 상대적으로 저렴하고 라이선싱 문제가 없으나 cap-0 구조의 mRNA를 합성한다. 따라서 추가적인 반응으로 mRNA 2’-O-methyltransferase 등의 enzyme을 사용해 cap-1구조로 변환해야 한다. 또한 ARCA의 capping efficiency (50~80%)는 CeanCap^®의 capping efficiency (>95%)와 비교하면 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있다.

■ CleanCap^® approach
Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133) 혹은 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)의 Linearized Template Vector는 transcription start site인 (그림 1) AGG 서열을 가지고 있다. 이는 CleanCap^® Reagent AG (No. N-7113 or N-7413)에 호환되는 서열이다.

CleanCap^® Reagent를 같이 사용하는 IVT 프로토콜과 vector에 대한 자세한 정보는 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (low dsRNA) (Code 6131) 혹은 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)의 사용자 매뉴얼을 참고 바랍니다.


그림 1. Linearized Template Vector의 Transcription start site. AGG 위치는 붉은 색으로 표시되었다. 이 vector는 Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133) 혹은Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)에 포함되어 있고 CleanCap^® Reagent AG (No. N-7113 or N-7413)에 호환된다.

■ ARCA approach
만약 ARCA를 사용해서 co-transcriptional capping을 한다면 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (low dsRNA) (Code 6131) 혹은 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)에서 transcription start site를 변경해야 한다. 이때 Linearized Template Vector의 start site (+1 position)을 A에서 G로 변경한다 (그림 2).


그림 2. transcription start site의 변경. Cap analog는 co-transcriptional capping을 위해 각각 다른 transcription start site를 필요로 한다. Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133) 혹은 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143) 에 포함되어 있는 Linearized Template Vector는 ARCA를 적용하기 위해서는 AGG에서 GGG (붉은색)로 변경해야 한다.

■ 관련제품
- Template 준비부터 IVT까지 고품질 고수율 시스템 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)
- [Upgrade] Template 준비부터 IVT까지 고품질 고수율 시스템 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (low dsRNA) (Code 6131)
- BspQ I과 같이 사용할 수 있는 IVT용 Template 제작 키트 Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133)
- IVT전 vector의 선형화에 사용하는 Type IIS 제한효소 BspQ I (Code 1227A)