Automated In-Fusion® Cloning
In-Fusion
® Snap Assembly Master Mix는 제한효소를 반드시 사용할 필요 없이 간단한 프로토콜을 통해 방향성 있는 정밀한 cloning을 가능하게 한다 (정확도 95% 이상).
In-Fusion
® Cloning 시스템의 사용 편의성과 정확성은 cloning 기술의 견고함을 지키면서 high-throughput 워크플로우에 적용하기에 가장 이상적인 시스템이다. 더불어, In-Fusion
® Cloning 시스템에 액체 처리 기반의 플랫폼을 적용한다면 자동화된 워크플로우 방법으로 응용될 수 있다. 현재 자동화 플랫폼에 적용할 수 있는 cloning 시약은 제한적이며, 아직까지 적용사례가 거의 없다. In-Fusion
® Snap Assembly는 액체 처리 기반 자동화 플랫폼에 적용 가능한 제품으로 짧은 시간 안에 많은 샘플을 동시에 처리할 수 있고, In-Fusion
®만의 장점인 높은 정확성은 유지하면서, 반응 당 비용을 줄일 수 있다.
* 이 외에 다른 플랫폼과의 호환성에 대해서는 다카라코리아 고객지원 (support@takara.co.kr, TEL. 02-2081-2510) 으로 연락 부탁드립니다.
Biomek i7 Dual Hybrid Workstation 적용 (클릭하여 데이터 보기)
* 미국 대형 제약사에서 활발한 연구 진행 중!
Platform : Biomek i7 Dual Hybrid Workstation (Beckman Coulter Life Sciences)
Kit : In-Fusion
® Snap Assembly Master Mix (Takara Bio)
Application: 96-well plate를 사용하여 자동화된 In-Fusion
® Cloning 반응 수행
Processing time : 96-well plate에 96 x 40 μl-sterile filtered tips (Beckman Coulter Life Sciences, Cat. # B85771)을 사용하여 10 μl 와 5 μl 볼륨의 96개 샘플을 cloning 반응하는 데에 42분 소요 (15분 In-Fusion
® 효소 반응시간 포함)
그림 1. Biomek i7 Dual Hybrid Workstation에 In-Fusion® cloning을 적용한 워크플로우 모식도.
Insert는 선형화된 벡터의 5’ 및 3’ 말단과 동일한 5’ 말단을 갖는 forward 와 reverse primer를 사용하여 PCR 증폭하였다.
정제 후, Biomek i7 Dual Hybrid Workstation을 사용하여 96 well plate에 분주되어 In-Fusion
® Snap Assembly 반응이 진행되었다. 반응 후, competent cell에 형질 전환하여 selective plate에서 콜로니를 배양하여 후속 분석을 진행하였다.
그림 2. Biomek i7 Dual Hybrid Workstation을 사용한 In-Fusion® cloning 반응의 콜로니 수와 정확도.
10 μl 와 5 μl의 반응부피를 테스트하였으며, 3회의 cloning 반응의 평균 콜로니 수를 그래프로 나타내었다. 오차 막대는 ± 표준편차를 나타내며, 콜로니의 정확도는 Sanger 시퀀싱으로 확인하였다.
epMotion® 5075t 적용 (클릭하여 데이터 보기)
Platform : ep
Motion® 5075t (Eppendorf)
Kit : In-Fusion
® Snap Assembly Master Mix (Takara Bio)
Application : 96-well 과 384-well plate를 사용하여 자동화 시스템에 적용하여 In-Fusion
® cloning 반응 수행
Processing time
1) 96-well plate : 108 x 10 ㎕ tip을 사용하여 10 ㎕ 씩 40개 샘플 분주 시 8분 20초 소요 (In-Fusion
® 효소 15분 반응시간 제외)
2) 384-well plate : 128 x 10 ㎕ tip을 사용하여 5 ㎕ 씩 40개 샘플 분주 시 14분 30초 소요 (In-Fusion
® 효소 15분 반응시간 제외)
Abstract
PCR 기반 seamless cloning 접근법은 스케일 업해서도 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 것이 더욱 중요하다. Eppendorf ep
Motion® 5075t 워크스테이션의 높은 정확도는 자동화 적용에 더욱 가치를 높여준다. 아래는 ep
Motion®이 적은 반응 부피를 사용하여 제한 효소 및 연결과정 (ligation) 없는 cloning을 자동화할 수 있는 과정을 보여준다. 이를 통해 In-Fusion
® Snap Assembly Cloning이 제공하는 높은 정확도를 유지하면서, 반응 당 비용을 절감할 수 있다.
그림 1. epMotion® 5075t을 이용한 자동화 In-Fusion® cloning 워크플로우. Insert는 선형화된 벡터의 5’ 및 3’ 말단과 동일한 5’ 말단을 갖는 forward 와 reverse primer를 사용하여 PCR 증폭하였다. 정제 후, epMotion
® 5075t를 사용하여 96 well 또는 384 well plate에 분주하여 In-Fusion
® cloning 반응을 수행하였다. 반응물은 competent cell로 형질 전환하여 selective plate에서 배양하여 이후 분석하였다.
그림 2. epMotion®을 사용한 In-Fusion® cloning 반응 설정. ep
Motion®으로 분리형 ('Seperate'로 표시) 및 혼합형 ('PreMix'으로 표시)의 두 가지 피펫팅 방식으로 In-Fusion 반응을 세팅하였다. 막대그래프로 표시된 값은 각 반응의 콜로니 수이며, 오차 막대는 ± 표준편자를 나타낸다. 정확도는 Sanger 시퀀싱을 통해 확인되었다.
Opentrons OT-2 적용 (클릭하여 데이터 보기)
Platform : OT-2 (Opentrons)
Kit : In-Fusion
® Snap Assembly Master Mix (Takara Bio)
Application : 96-well plate를 사용하여 자동화 시스템에 적용한 In-Fusion
® cloning 반응 시행
Abstract
Cloning 워크플로우를 자동화하면 처리량을 늘릴 수 있고 변수를 최소화할 수 있지만, 자동화 플랫폼과 호환이 되는 cloning 시약은 거의 없다. In-Fusion
® Snap Assembly Master mix를 사용하여 Opentrons의 OT-2 플랫폼에서 빠르고 간단한 cloning 워크플로우를 자동화하는 것을 평가하였다.
그림 1. OT-2 플랫폼을 사용한 자동화된 In-Fusion® Snap Assembly 반응 설정. Insert는 선형화된 벡터의 5’ 및 3’ 말단과 동일한 5’ 말단을 갖는 forward 와 reverse primer를 사용하여 PCR 증폭하였다. 정제 후, PCR 산물과 선형화된 벡터 그리고 In-Fusion
® Snap Assembly Master Mix를 OT-2 liquid handler를 사용하여 96 well plate에 분주하였다. Cloning 반응 후 competent cell에 형질 전환하여 selective plate에서 콜로니를 배양하여 이후 분석을 진행하였다.
그림 2. 10 ㎕ 또는 5 ㎕의 반응 부피로 형질 전환한 후 colony forming units (CFU)의 계산. 그래프로 나타낸 값은 OT-2 플랫폼을 사용하여 DNA 단편 insert를 포함하거나 (OT-2 test group - 파란색), 포함하지 않는 (OT-2 negative control - 노란색) 세 개의 독립적인 cloning 반응에서 얻은 CFU의 평균 수이다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타내며, 수동 피펫 (manual pipette- 연한 하늘색)을 사용한 단일 cloning 반응을 참고로 표시하였다.
High throughput Automated In-Fusion Cloning을 위한 대용량 제품
