■ 목적
E. coli를 이용한 IVT template 제작법은 많은 양을 짧은 시간에 얻기 어려우므로, phi29 DNA polymerase (Code RR340A)를 활용하여 짧은 시간 안에 IVT template을 대량 확보하는 것을 목표로 한다.

■ 방법
- Template: FLuc BspQI vector (circular), 5ng
- 프라이머:

1.     ① Random primers (3' Phosphorothioate-modified Random Hexamer (Code 3807))
2.     ② 3’ 말단이 phosphorothioate로 수식된 specific primer^*
3.     ③ Unmodified specific primer

^* phi29 DNA polymerase의 exonuclease 활성에 의한 분해를 방지하기 위함
- 20ul 반응계에서 30°C, 16시간 반응 후 샘플을 정제하여 BspQI를 처리한 뒤, 이를 template으로 Takara IVTpro^® T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA) (Code 6134)와 IVTpro^® T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)로 IVT 반응 수행하였고, 양성 대조군으로 linearized FLuc BspQI 벡터를 template으로 사용하였다.

■ 실험 구성

IVT template	합성용 primer	특징
IVT template -1	Random primer	비특이적 증폭
IVT template -2	pVAX1 P1 (phosphorothioate-modified) + Poly(A) Primer R (phosphorothioate-modified)	특이적 + 3’ 보호
IVT template -3	pVAX1 P1 (unmodified) + Poly(A) Primer R (unmodified)	특이적 + 3’ 비보호

- phi29 DNA polymerase를 이용한 IVT template 준비 절차

시약	Stock 농도	Final 농도	1 rxn
Nuclease-free water	-	-	9 ㎕
10× phi29 Buffer	10x	1x	2 ㎕
IVT template (위의 표 참조)	각 100 μM	각 5 μM	각 1 ㎕
dNTP mix	10 mM each	2 mM	4 ㎕
FLuc BspQ I vector (circular)		5 ng/rxn	2 ㎕
Total volume			19 ㎕
↓
95℃ 5 min, ice cooling 2 min
↓
1 ㎕ phi29 DNA Polymerase (10 U/㎕)
↓
30 ℃, 16 h 반응
↓
정제

■ IVT 결과
IVT template (1, 2, 3)을 Takara IVTpro^® T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA) (Code 6134)와 IVTpro^® T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)로 반응하였고, 최종적으로 mRNA 수율 측정과 아가로스 젤 전기영동 분석으로 증폭양을 확인하였다.

그림 1. phi29 DNA polymerase를 이용하여 합성한 IVT mRNA

표 1. phi29 DNA Polymerase로 합성한 template를 IVT하였을 때 mRNA 수율 (yield)

IVT kit	CleanCap (mM)	IVT mold	mRNA yield 평균 (㎍)
6134	4 mM	FLuc BspQ I vector	197.04
		IVT template-1	193.53
		IVT template-2	178.66
		IVT template-3	184.06
6144	8 mM	FLuc BspQ I vector	206.08
		IVT template-1	198.37
		IVT template-2	194.86
		IVT template-3	199.18

■ 결론
- phi29 DNA Polymerase를 이용하여 Rolling Circle Amplification (RCA) 방법으로 증폭한 DNA로 준비한 template으로 IVT mRNA를 합성한 결과, 양성대조군 (기존 E. coli 기반 플라스미드 제작 방식으로 준비한 template)과 비교했을 때 mRNA의 합성 수율과 품질이 유사한 수준을 보였다.

[참고] phi29 DNA Polymerase의 3′→5′ exonuclease 활성이 프라이머를 분해할 수 있어 3′ 말단이 보호된 프라이머의 사용이 필요하다

■ 관련 제품
CDS 증폭을 위한 high fidelity PCR 효소: PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase Ver.2 (Code R047A)
IVT용 Plasmid template을 간단하게 제작하는 Kit:  Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133)
BspQ I 인식서열이 있는 IVT template vector: Template Vector (BspQ I) for T7 mRNA Synthesis (Code 6146)
IVT전 vector의 선형화에 사용하는 Type IIS 제한효소: BspQ I (Code 1227A)