■ mRNA 연구가 확대될수록 커지는 'RNA Quality'의 중요성
최근 mRNA 기술은 감염병 백신뿐 아니라 암 면역치료, 유전자 치료, 유전자 편집(CRISPR), 단백질 대체 치료 등 다양한 분야로 빠르게 확대되고 있다. 이러한 응용 분야가 넓어짐에 따라 연구 단계뿐 아니라 임상 개발과 제조 공정에서도 고품질 mRNA 생산을 위한 품질 관리(Quality Control)의 중요성이 더욱 커지고 있다.
그러나 In Vitro Transcription (IVT)으로 합성된 RNA에는 원하는 mRNA 외에도 다양한 부산물이 함께 생성된다. 대표적인 예로는 uncapped mRNA, abortive RNA fragment, DNA/RNA hybrid, 그리고 double-stranded RNA (dsRNA)가 있다.¹⁾ 이러한 불순물은 IVT mRNA의 안전성 (safety), 효능 (efficacy), 그리고 재현성 (reproducibility)에 영향을 줄 수 있기 때문에 IVT 과정에서 반드시 고려해야 하는 품질 요소이다.

■ 왜 dsRNA가 중요한가?
많은 연구자들은 IVT 반응에서 높은 RNA 수율을 얻는데 집중한다. 하지만 높은 수율이 반드시 높은 품질의 mRNA를 의미하는 것은 아니다.
IVT 과정에서 생성되는 dsRNA는 단순한 부산물이 아니라 mRNA 효능에 직접적인 영향을 미치는 불순물이다. 선천면역 반응을 유도하고 단백질 발현을 저해할 수 있으므로, IVT 과정에서 생성된 dsRNA를 효과적으로 관리할 경우 면역 활성은 감소하고 단백질 발현은 향상된다.²⁾

[그림 1] IVT 과정에서 생성되는 dsRNA가 mRNA 품질과 성능에 미치는 영향
즉, dsRNA는 단순한 부산물이 아니라 mRNA의 품질을 좌우하는 중요한 불순물(impurity)이자 Critical Quality Attribute (CQA)로 관리되어야 하는 요소라고 할 수 있다.

■ dsRNA는 언제 관리해야 할까?
많은 연구에서는 정제 과정 이후 최종 RNA의 품질을 평가하는 데 집중한다. 그러나 dsRNA는 IVT 반응 과정에서 생성되기 때문에, 정제 이후가 아닌 공정 초기부터 관리하는 것이 중요하다.

특히 효소, template, buffer 조건 등을 반복적으로 최적화하는 공정 개발 단계에서는 각 조건에서 생성되는 dsRNA 수준을 빠르게 확인할 필요가 있다. 이를 통해 불필요한 반복 실험을 줄이고, 보다 효율적으로 최적 조건을 선정할 수 있으며, 이후 scale-up 과정에서도 일관된 품질을 유지하는 데 도움이 된다.

무엇보다 dsRNA의 가장 큰 문제는 존재 자체보다 '너무 늦게 발견되는 것'이다. 공정 후반에서 높은 dsRNA 수준이 확인되면 조건을 다시 최적화해야 하므로 시간과 비용이 크게 증가할 수 있다. 따라서 개발 초기 단계부터 dsRNA를 지속적으로 모니터링하는 것이 효율적인 공정 개발의 핵심 전략이 되고 있다.

[그림 2] dsRNA가 mRNA 성능에 미치는 결과

■ dsRNA를 줄이는 가장 효과적인 방법은?
기존에는 생성된 dsRNA를 제거하기 위한 Purification에 많은 노력을 기울여 왔다. 하지만 최근에는 접근 방식이 조금씩 바뀌고 있다. "생성된 dsRNA를 제거하는 것보다, 처음부터 dsRNA를 적게 만드는 것이 더 효율적이다."

PrimeCap^® T7 RNA Polymerase (low dsRNA) (Code 2560A)는 이러한 요구를 반영하여 개발된 효소다. IVT 단계에서 dsRNA 생성 자체를 줄임으로써 이후 정제 부담을 낮추고, 보다 높은 품질의 mRNA 생산을 기대할 수 있다. 이는 연구 단계뿐 아니라 향후 GMP 생산으로 확장할 때도 동일한 workflow를 유지하는 데 도움이 될 수 있다.

[그림 3] FLuc mRNA (약 1.9 kb)의 합성 수율 (A), dsRNA 생성률 (B) 및 dsRNA의 비율 (C) Positive Control Template (FLuc) (Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)의 구성품)을 주형으로 T7 RNA Polymerase ver.2.0 (Code 2541A)와 본 제품을 사용해 mRNA 합성을 비교한 결과 (20 ㎕, 사용예 참고), 본 제품이 mRNA 합성 수율의 저하 없이 dsRNA 생성률을 90% 이상 감소시키는 것을 확인할 수 있다

■ dsRNA 생성만 줄이면 충분할까?
Low dsRNA 효소를 사용한다고 해서 실제 생성된 dsRNA 수준을 확인할 필요가 없어지는 것은 아니다. 기존에는 ELISA, Dot blot, HPLC 등의 방법이 주로 사용되어 왔지만, 각각 분석 시간이 길거나 전문 장비가 필요하고, 정량성 또는 사용 편의성 측면에서 한계가 있었다. 최근에는 이러한 문제를 해결하기 위해 빠르고 간편하게 dsRNA를 정량할 수 있는 분석 방법에 대한 관심이 높아지고 있다.

Takara의 dsRNA GoStix™ Plus (Code 635860)는 약 10분 만에 dsRNA를 정량할 수 있으며, 별도의 분석 장비 없이 스마트폰 앱을 이용하여 간단하게 결과를 확인할 수 있다. 또한 ELISA와 유사한 농도 의존적 결과를 제공하면서도 분석 시간을 크게 단축할 수 있어, IVT 공정 중 신속한 품질 확인 (In-process QC)에 활용할 수 있다.

[그림 4] dsRNA GoStix™ Plus 사용 예시

■ Conclusion
mRNA 기반 치료제와 백신 개발이 확대됨에 따라 dsRNA는 단순한 부산물이 아니라 mRNA의 품질과 성능을 좌우하는 중요한 품질 관리 항목(CQA)으로 인식되고 있다.

앞으로의 IVT workflow에서는 단순히 높은 RNA 수율을 확보하는 것뿐 아니라, IVT 단계에서 dsRNA 생성을 최소화하고 이를 신속하게 모니터링하는 전략이 더욱 중요해질 것으로 기대된다.

Takara는 PrimeCap^® T7 RNA Polymerase (low dsRNA) (Code 2560A)를 통한 Low dsRNA generation과 dsRNA GoStix™ Plus (Code 635860)를 활용한 Rapid dsRNA quantitation을 통해 연구 단계부터 GMP 생산까지 일관된 IVT workflow 구축을 지원한다.

1)		Lenk R, Kleindienst W, Szabó GT, Baiersdorfer M, Boros G, Keller JM, Mahiny AJ, Vlatkovic I. Understanding the impact of in vitro transcription byproducts and contaminants. Front Mol Biosci. 2024 Jul 10;11:1426129. doi: 10.3389/fmolb.2024.1426129. PMID: 39050733; PMCID: PMC11266732.
2)		Karikó K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res. 2011 Nov;39(21):e142. doi: 10.1093/nar/gkr695. Epub 2011 Sep 2. PMID: 21890902; PMCID: PMC3241667.