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In vitro에서의 Cloning

TaKaRa LA PCR™ in vitro Cloning Kit

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제품설명

본 제품은 Cassette와 Cassette Primer를 사용해 plasmid나 cDNA 혹은 gDNA의 미지의 영역을 증폭하는 기존 PCR in vitro Cloning Kit 방식에 길이가 긴 DNA를 정확하게 증폭하는 TaKaRa LA Taq®을 적용한 시스템이다. TaKaRa LA Taq®은 기존 TaKaRa Taq™보다 높은 fidelity를 가지기 때문에 cloning 과정에서 우려되는 변이의 가능성이 낮아졌다. 본 제품을 이용하면 gDNA 등의 길이가 긴 DNA의 미지의 영역을 일부 known region의 primer만으로 library construction이나 screening 없이 간편하게 cloning이 완료된다.

내용 (10회)

Sau3A I Cassette (200 ng/㎕)	25 ㎕
EcoR I Cassette (20 ng/㎕)	25 ㎕
Hind III Cassette (20 ng/㎕)	25 ㎕
Pst I Cassette (20 ng/㎕)	25 ㎕
Sal I Cassette (20 ng/㎕)	25 ㎕
Xba I Cassette (20 ng/㎕)	25 ㎕
Cassette Primer C1 (10 pmol/㎕)	20 ㎕
Cassette Primer C1 (10 pmol/㎕)	20 ㎕
Ligation Solution I *	150 ㎕
Ligation Solution II＊	78 ㎕
TaKaRa LA Taq (5 U/㎕)	10 ㎕
10×LA PCR Buffer II (Mg²⁺ plus)	100 ㎕
dNTP Mixture (각 2.5 mM)	160 ㎕
Control DNA Fragment (100 ng/㎕)	25 ㎕
Control Specific Primer CS-1 (10 pmol/㎕)	10 ㎕
Control Specific Primer CS-2 (10 pmol/㎕)	10 ㎕

* DNA Ligation Kit Ver.2.1 (Code 6022)에 포함된 시약과 동일

보존 -20℃

원리

1. 타겟 DNA를 적당한 제한효소로 digestion
2. 사용한 제한효소와 일치하는 Cassette를 타겟 DNA에 ligation
3. Cassette Primer C1 과 known region의 Primer S1 으로 1^st PCR
4. 3번의 반응액의 일부를 Cassette Primer C2, known region의 Primer S2로 2^nd PCR을 통해 타겟 DNA 증폭

그림 1. TaKaRa LA PCR™ in vitro Cloning Kit의 원리

Cassette의 5’-end가 탈인산화 되어있어 Cassette의 5’-end와 타겟 DNA 3’-end의 ligation site에 nick이 생성된다. 타겟 DNA에서 Cassette Primer C1으로부터 합성된 DNA는 이 nick에서 합성을 멈춰 비특이적 증폭이 일어나지 않는다. 오직 Primer S1에서부터 합성된 DNA만이 Cassette Primer C1의 주형으로 사용되어 DNA가 합성된다. 이후 더 안쪽의 primer (Primer C2, Primer S2)로 2nd PCR을 진행하는 것으로 더욱 효율적으로 특이적인 DNA를 합성할 수 있다.
이를 통해 타겟 단백질의 아미노산 서열을 일부 알고 있는 경우에도 그 정보를 바탕으로 제작한 mixed primer를 사용해 타겟 단백질을 코딩하는 cDNA를 합성할 수 있다.

용도

- Long-fragment의 cloning
- Long-range의 PCR과 cloning

사용상의 주의

이 제품에의 각 Cassette에는 T7 promoter 서열이 포함되어 있어 1^st PCR 및 2^nd PCR에서 얻은 PCR 산물에 T7 promoter 서열이 포함되어 있다. 따라서 PCR 산물을 T7 promoter primer로 sequencing 할 수 있다. 반면 T7 promoter를 포함한 vector (pT7 Blue T-vector 등)에 PCR 산물을 Cloning한 경우는 T7 promoter primer를 사용하여 sequencing 할 수 없다.

Keyword :

TA-Cloning, 평활말단 Cloning

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