PCR 초기의 mispriming에 의한 비특이적인 증폭을 줄이기 위하여 hot start용 효소를 권장한다. 그 중 TaKaRa Taq™ hot start version이 multiplex PCR에 적합하다.
※ TaKaRa Ex Taq® hot start version에서는 첨부된 buffer의 Mg²⁺ 농도가 TaKaRa Taq™ hot start version에 첨부된 buffer 보다도 높기 때문에, 비특이적 증폭이 일어나기 쉽다.

반응계 구축시에는 다음 사항을 고려해야 한다.
[증폭 산물 설정과 primer 설계]

• Primer 설계시 Foward와 Reverse의 Primer의 Tm값 차이를 가능한 작게 하고 GC 함량을 가능한 골고루 한다.
• PCR 반응의 증폭 효율이 같도록 설정 한다. · 증폭 산물이 1,000 bp 이내가 되도록 설정 한다.
• 설계한 primer에 대해서는 미리 실험하여 비특이적 증폭 유무 및 반응성을 확인하고, template를 첨가하지 않은 negative control도 동시에 반응하여 primer dimer의 유무를 확인 한다. 그 결과, 비특이적 증폭이 많은 primer는 사용하지 않는 편이 좋다(비특이적 증폭 산물이 적을 경우, multiplex PCR로 하면 사라지는 경우도 있다).

[반응조건]

• Extension 시간: 1,000 bp까지의 multiplex PCR인 경우, 72℃에서 1분을 기준으로 반응하고 증폭량이 충분 하지 않을 경우는 extension 시간을 길게 한다(extension 시간을 필요 이상으로 길게 하면 비특이적 증폭이 발생할 수 있다).
• Annealing 온도: 1℃ 간격으로 적절한 온도를 검토 한다(annealing 시간을 필요 이상으로 길게 하면 비특이 적 증폭이 발생할 수 있다).
• PCR 증폭이 끝난 후, 72℃, 10분의 step을 추가하면 smear 현상을 줄일 수 있다.