Agenda 00:07

본 영상은 일반 PCR과 Quantitative real-time PCR(또는 qPCR) 비교 후 RNA를 상보적인 cDNA로 전환하는 reverse transcription(역전사)과 quality control, 그리고qPCR 실험의 최적화 방법 순으로 진행하겠다.

PCR원리 00:38

PCR은 1996년 Kerry Mullis 에 의해 고안된 핵산 증폭 기술이다. 타겟 핵산을 포함한 샘플에 primer, dNTPs와 내열성 DNA polymerase를 첨가한다. 내열성 DNA polymerase는Thermus aquaticus유래의 Taq polymerase가 가장 일반적이다. 반응은 DNA 가닥을 분리하기 위해 95℃로 가열하는 melting단계, 그 후 온도를 55~65℃로 낮춰 프라이머가 붙는 annealing 단계와 마지막으로 Taq polymerase에 최적화된 72℃에서 주형에 상보적인 가닥을 만드는 primer extension 단계로 구성되어있다. 이 반응 과정은 이중가닥 분자를 효과적으로 복제하며 이 과정을 20cycles 반복하면 초기 존재하던 타겟 분자의 10⁴까지 증폭할 수 있다. Kerry Mullis는 PCR 개발 공로로 1993년 노벨 화학상을 수상했다.

End point vs. Real-time 02:48

Russell Higuchi는 형광dye를 첨가해 증폭되는 DNA에 결합된 형광의 증가를 통해 DNA 증폭을 확인 할 수 있도록 PCR 방법을 향상시켰다. Y축은 결합된 dye의 형광 강도이고, X축은 PCR cycle 수를 의미한다. 데이터는 log7을 10배씩 단계적으로 희석한 것이다. 농도가 높은 샘플일수록 형광이 더 일찍 나타난다. 기존 end-point PCR로 샘플들을 비교하면, 24 cycles(파란색 선 부분)을 보면 농도가 높은 샘플 두 번째부터 다섯 번째까지 시그널이 명확하게 분리되지만 기존 end-point PCR의 경우, 가장 많이 희석된 샘플 3개는 증폭량이 적어 구별할 수 없거나 가장 높은 농도의 2개 샘플은 PCR 후 saturation되어 동량이 증폭되므로 농도를 구별할 수 없다. 고정된 PCR cycle 후 PCR 증폭량을 비교하면 검출 할 수 있는 범위(dynamic range)가 제한적이다. 그러나 녹색선으로 표시된 형광 임계치(fluorescence threshold level)에 도달하는 cycle 수를 비교하면 모든 샘플의 시그널을 구별 할 수 있고 PCR 반응 내내 실시간으로 PCR 산물의 양을 비교할 수 있어 Real-time PCR의 dynamic range는 거의 무한대이다.

Dyes vs. Probes 05:27

PCR 산물양은 dsDNA에 결합하여 형광 물질을 증가시키는 reporter dye에 의해 모니터링 된다. Molecular Probes에서 개발된 SYBR Green I 가장 인기가 있다.

(Reporter dyes bind dsDNA 05:56

SYBR Green은 double stranded DNA의 groove부위에 결합하여 강한 형광을 띈다.

Dyes and Probes 06:19

대체 reporter 방법으로 여러가지 probe 방법이 있다. 가장 인기는 있는 것은Ken Livak.에 의해 개발된 Taqman probe 이다. Dye reporter가 모든 dsDNA에는 껴들어가는 반면 probe는 서열 특이적으로 작용한다.

Hydrolysis probes 06:47

Hydrolysis probe는 양쪽 말단이 dye와 quencher로 된 oligonucleotide로 온전한 상태일 때는 dye의 에너지가 quencher로 전이되어 형광을 나타내지 못하다가 PCR동안 primer의 upstream 부위의 주형과 결합된 probe가 Taq polymerase의 exonuclease 활성으로 가수분해되면서 quencher와 분리된 dye가 형광을 띄게 된다.

(Dyes vs. Probes. Pro and cons 07:36)

Dye reporter는 서열 비특이적이고 반응당 단일 타겟을 검출하지만, probe는 여러 대상을 동시에 검출 할 수 있다.

Multiplex qPCR 07:54

Probe마다 다른 증폭산물(amplicon)을 타겟으로 디자인되며, 각 probe는 구분 가능한 dye로 라벨링된다. 각 dye의 형광은 qPCR 장비의 다른 channel에서 확인 된다.

Dyes vs. Probes. Pro and cons 08:16

Probe는 타겟 서열로부터 증폭된 산물(amplicon)과 비특이적 산물로 구분한다. Dye reporter는 dsDNA에 껴 들어가 형광을 발현하기 때문에 비특이적 산물을 구분할 수 없다.

Melting curve analysis (dye based reaction) 08:41

Dye를 이용한 qPCR에서는 PCR 후 melt curve 분석을 통해 비특이적 산물의 증폭을 구분할 수 있다. PCR 완료 후, 샘플을 점차적으로 가열하면 dsDNA가 ssDNA로 변성되면서 dye가 분리되고 형광 값이 떨어진다.

Validating PCR products

DNA의 온도 안정성은 melting temperature(TM)으로 명시하는데 TM은 DNA strand의 50%가 분리되는 온도를 의미하며 PCR산물의 길이, GC함량, 염기 서열에 따라 분리되는 온도가 다르다. Melting curve를 미분하여 얻은 것으로 TM은 melting curve의 기울기가 최대 마이너스 값일 때의 변곡점이다. Dye를 이용한 검출법 이용시 melting curve로 primer dimer와 같은 비특이적 산물과 구분하기 위해선 타겟 증폭 산물을 좀더 길게 디자인해야 한다.

The primer dimmer (PD) problem 10:25

드물지만 primer의 self priming으로 신장(extension)되는 경우가 있다. 이렇게 신장된 산물은 PCR 반응 시약을 고갈시키고 목적 유전자의 증폭이 지연되면서 Cq values를 높이기 때문에 probe법 적용시에도 문제가 된다.

Suppressing primer dimmer formation 11:07

Primer-dimer 형성은 primer의 2차 구조와 primer간의 상보성, 특히 3’말단의 상보성을 피함으로써 억제된다.

Suppressing primer-dimer formation 11:25

Hot Start 기술은 온도를 올려 활성화(activation)시킬 때까지 시약 혼합물을 불활성화(inactivation) 상태로 유지 시켜준다. 일반적으로 열에 민감한 항체(antibody)를 이용해 polymerase를 불활성화시키지만 polymerase를 가역적인 화학적 불활성화 방법, primer와 같은 필수 반응 구성요소를 분리시키는 방법 등이 있다. 샘플을 준비하는 과정에서 polymerase와 primer는 가급적 분리해서 보관해야 하고 섞은 후에는 얼음에 보관해야 한다. PCR 산물의 추가 반응이 필요하다면 reaction mix는 냉장보관하고 가급적이면 PCR 은 불활성화시키는 게 좋다

Dyes vs Probes Pro and cons 12:36

Dye reporter를 이용하면 디자인이 간편하고 비용이 저렴하다. Dye 법은 일반적인3 step PCR을 적용하는 반면 probe법은 annealing과 extension step으로 구성된 2 step PCR 프로토콜을 적용한다. (13:20) 요약하면, dye-based assay는 많은 타겟을 단일 반응으로 동시에 검출하고자 하는 발현 프로파일링에 적합하고 false positive signal을 제거에 덜 민감하다. 그러나 probe-based assay는 false positive signal이 없어야 하며 다중반응(multiplexing)이 필요할 때, 또는 폐쇄된 tube 시스템이 필요한 병원균 진단에 더 적합하다.

(First commercial real-time PCR instruments 13:51)

초기 qPCR 장치로 Taqman 기기로 알려진 ABI 7700과 Idaho Technology LightCycler가 있다. 이 기기들은 분자 진단의 새로운 전기를 열었지만 현재는 구제품이 되었다.

(Real time PCR instruments 14:22)

요즘은 qPCR 기기들은 사용하기 쉽고 더 소형화되었다. 임상 진단용인 Roche의 Cobas Taqman이나 대용량 실험용 Life Technologies의 Quantstudio 같은 특화된 장비들이 있기도 하지만 일반 실험실에서는 다양한 브랜드에서 나온 96 well이나 384 well plate용 기기를 선호한다.

(Assay design for transcripts 15:15)

cDNA를 이용한 실험에 사용되는 primer는 gDNA도 증폭할 수 있기 때문에 주의해야 한다.
유전자가 intron을 포함한다면 프라이머는 intron을 걸치거나 exon-exon경계를 가로질러 설계해야 한다. 이렇게 설계된 primer 들은 일반적인 genomic DNA를 증폭할 수 없다.

(No RT Controls 15:37)※

모든 유전자가 intron을 갖는 것은 아니다. 또한 인간 유전자의 약 15% 정도가 primer 설계로 증폭을 피할 수 없는 pseudogene을 갖고 있다. 몇몇 유전자는 genomic DNA로부터 높은 백그라운드 증폭을 만드는 수백 개의 pseudogene을 갖고 있는 경우도 있다. 이런 백그라운드는 -RT control(RT 효소 첨가 없음)로 비교할 수 있다. -RT PCR control 반응은 RT 단계에서 RT 효소가 없이 RT반응이 진행된다. genomic DNA에 의한 영향을 무시하기 위해서는 일반적인 RT-qPCR(RT효소 첨가)와 -RT-PCR control(RT 효소 없음) 사이에 Cq 값이 5 cycles이상 차이가 나야 한다. 본 실험은 nuclease 처리없이 진행된 반응이다. 만약 차이가 불충분하면 dsDNA specific nuclease를 처리해서 +RT와 -RT 차이를 증가시키는 방법도 있다. 다른 대안은 gDNA로 부터 증폭된 백그라운를 제거하기 위해 최근 개발된 valid-prime protocol을 이용하는 방법이 있다.

(Some practical tip 17:29)

qPCR세팅시 PCR전 실험, template첨가, PCR후 실험을 분리된 공간에서 진행하면 오염 가능성을 최소화 할 수 있다. Master mix는 UV 후드에서 준비하는 게 적합하다. 실험 할 땐 UV를 끄고, 실험하지 않을 때는 핵산을 파괴하도록 UV를 켜놓는다. Tube 를 열 때 PCR산물이 튀어 실험실을 오염시킬 수 있으므로 고농도DNA 샘플을 사용할 때는 filter tip과 screw-cap tube를 사용해야 한다. Pipetting의 정확성을 위해서는 1 ul 이하는 피하는 게 좋다.

(Reverse Transcription 18:53)

qPCR로 RNA를 분석하기 위해선, RNA를 cDNA로 전환해야 한다. 1975년에 노벨상을 받은Howard Temin와David Baltimore에 의해 발견된 reverse transcriptase는 RNA를 상보적인 DNA로 전환시켜준다.

(RT Priming 19:30)

Reverse transcription은 primer첨가 없이도 진행되지만 primer를 첨가하면 이를 도울 수 있다. 세가지 primer 적용 방법이 있다. (i) Gene specific primers로 특정 유전자를 직접 transcription에 사용하는 방법으로 transcription에 이용했던 동일한 primer가 PCR 에서는 reverse primer로 작용한다. Gene specific primer는 1개의 타겟을 가진 진단분야에서 선호되고 있다. (ii) Oligo dT primer는 polyA tail을 가진 RNA의 reverse transcription에 적용할 수 있다. 대부분의 진핵생물의 RNA는 A tail을 갖고 있어 cDNA내 mRNA를 농축할 수 있고 priming의 편향성이 적다는 장점이 있다. (20:26) 그러나 만약 RNA가 분해된 단편이라면 reverse transcription시 타겟 부위에까지 증폭되지 못하는 단점이 있다. (iii) Random sequence primer는 모든 RNA의 모든 부위에 결합하여 효과적으로 reverse transcription시킬 수 있다. Random primer는 hexamer이거나 더 긴 경우도 있다. 더 긴 primer는 더 높은 온도에서 reverse transcription반응을 해야 한다. 많은 Kit는 Oligo dT와 random sequences primer가 섞인 혼합물을 이용한다. 이 방법은 동시에 여러 개의 단일 반응을 진행하는 발현 프로파일링에 추천한다.

(dependence on priming method 21:45)

5 종의 타겟을 세 가지 RT priming 방법으로 비교했을 때 더 우세한 것은 없었다. 어떤 유전자는 random sequence primer로 더 높은 RT 산물을 얻은 반면 어떤 것은 Oligo dT primer사용시에 더 우세했다. 사용하는 primer 차이는 몇 cycle(증폭양)의 차이 일 수 있다.

(GAPDH 3’ 22:11)

효과적인 RT priming에 중요한 점은target sequence가 있는지 여부이다. 온도를 높일수록 hybridization이 증가되고 priming efficiency를 향상시킬 수 있다. RNA의 2차 구조는 온라인 툴로 예측할 수 있다.

(Dependence on enzyme 22:48)

RT 양은 사용하는 reverse transcriptase에 따라 달라진다. 8개의 reverse transcriptases로 serotonin receptor gene transcript를 반응시켰을 때 100배까지 양의 차이를 보였다.

(Effect is gene dependent 23:10)

이 증폭 효과는 유전자에 따라 다르다. 어떤 유전자의 RT효율은 reverse transcriptase 에 따라 차이가 나는 경우도 있고 없을 수도 있다.

(One Step RT reactions vs Two Step RT reactions 23:32)

RT-qPCR는 one step reaction이 가능하다. One step reaction은 매우 편리하지만 몇 가지 단점이 있다. (i) random sequence primers는 사용 불가하다. (ii) qPCR은 multiplex임에도 불구하고, 한 반응 당 하나의 타겟만 분석 가능하다. (iii) 일반적으로 전반적인 성능이 낮다. 그러나 one step RT-qPCR protocol 은 전염성 있는 샘플을 분석시 밀폐된 tube 분석이 가능하다는 장점이 있다. 일반적인 two step RT와 qPCR 반응은 각 반응을 최적으로 조건으로 설정할 수 있어 대부분 다른 분야에 적용되고 있다.

(qPCR & RT experimental variation 24:29)

분석 과정의 각 단계마다 별도의 반응으로 동시에 분석하기 위해 샘플을 aliquot할 수 있다. 분주된 Cq 값은 하위 반응의 재현성을 반영한다. 그림의 왼쪽 패널은 qPCR을 위해 샘플을 aliquot했고 오른쪽 패널은 RT 를 위해 aliquot하였다.(25:06) 왼쪽의 qPCR aliquot이 RT aliquot보다 더 높은 재현성을 보임을 보여주고 있다.

(Nested pilot study (replicants made at each step 25:35))

중요한 실험 전 완벽한 예비 실험을 수행하는 것이 좋은 방법이다. 소수의 샘플로 시작해서 각 검체(subject)마다 복수의 샘플을 수집하고 중요 실험 단계 마다 각 샘플을 aliquote하면 실험 단계에 따른 변화를 확인하고 최적화 가능한 단계를 파악할 수 있다. 이를 이용해 더 큰 규모의 실험을 진행할 때 조건과 비용의 최적화를 할 수 있다. 4 단계 실험 진행시 각각 3개의 aliquots로 실험을 진행하면 3 x 3 x 3 x 3 으로81번 측정이 필요하다. 이것은 1회의 run으로 측정 가능하다.

(Identify the source of variation 26:41)

이 그래프는 4 단계로 된 예비 실험의 예이다. 주제는 high furs, sampling, reverse transcriptions과qPCR이다. 왼쪽 패널은 간 샘플이고 오른쪽은 혈액 샘플이다. 예비 실험에서는 4 종류의 유전자를 분석했다. 간 샘플에서는 대부분의 다양성이 고체조직의 여러 다양한 특성이 반영되는 샘플링 단계에서 도입되는 것을 볼 수 있다. 혈액 샘플에서는 cytokine이 관찰된 검체(inter-subject)의 다양성은 아마도 동물 중 아픈 개체가 있음을 알려 준다. 샘플링 단계에서 차이는 균질한 혈액에서 예상 되는 것만큼 무시할 만하다.

(Conclusion 27:56)

결론적으로 multiplexing이 필요한 병원균 진단이나 one step RT-qPCR protocol이 필요할 때는 probe법이 선호된다. 많은 marker를 테스트 해야 하는 스크리닝 단계의 유전자 발현 프로파일링에는 dye 법이 더 적합하다.
Transcript를 증폭하는 실험시 genomic DNA도 증폭될 수 있다. 만약 gDNA가 문제가 된다면 double-strand specific nuclease를 이용해 gDNA를 제거해야 한다.
Reverse transcription시 random sequence primer와 Oligo dT primer는 유전자 발현 프로파일링에 이용하고 one step RT-qPCR에는 gene specific primers를 사용한다.
대규모 실험을 진행하기 전 예비 실험을 통해 variation이 일어나는 단계를 파악하고 향상시킨다. RT-qPCR증폭량은 유전자에 따라, 실험 조건에 따라 차이가 난다. 동일한 protocol, 동일한 시약, 동일한 실험 조건하에서 모든 샘플을 분석해야 한다. Cq 값은 기기에 따라 차이가 있기 때문에 비교하기는 어렵다. 그러나 동일 protocol로 분석한 샘플간에는 ΔCq 값을 비교할 수 있고 다른 protocol을 사용했어도 ΔΔCq 값은 비교할 수 있다.