qPCR 분석시 나타날 수 있는 문제에 대해 이야기 하겠다.
어떻게 문제를 식별 방법과 해결 방안이 무엇인지 발표하겠다.
우선, qPCR 과정 중에 일어날 수 있는 문제에 대해 이야기 한 후, 반응 저해 요인과 RNA 및 RT 과정에 대해 얘기하겠다.

증폭곡선의 형태가 이상한 것은 백그라운드 제거 시 오류로 인한 것일 가능성이 있다. SYBR green을 반응에서 나온 한 쌍의 곡선(남색)이 아래로 기울어졌다면, 말단 부위 형광 값이 유지되지 않고 감소하는 것이다.
위쪽 백그라운드를 제거하지 않은 곡선을 보면, 곡선이 정상적인 형태를 갖고 있으며 백그라운드 제거시 잘못된 요인이 있었다는 것으로 볼 수 있다. 이 경우는 baseline 제거 시 형광이 나타난 cycle까지도 백그라운드로 여기고 제거되었기 때문이다. 이런 문제가 일어날 경우, 몇몇 qPCR 장비에서는 수동으로 백그라운드를 제거하는 cycle 수를 변경할 수 있다. 제거 범위는 변곡점(inflection point) 이전의 cycle이어야 한다. 백그라운드 제거 조건을 변경한 후, 곡선이 정상적인 형태가 되었고 정확한 정량이 가능하다.

증폭곡선의 모양을 보면 PCR 반응 동안 일어났던 현상을 알 수 있다. 만약 백그라운드의 형광 값이 튄다면, 이것은 벽에 거품이 터져서 나타난 것이다. 만약 이런 튄 현상 이후 cycle을 0 수준으로 제거 가능하다면 정량에 영향을 주지 않는다. 다른 중요한 요소는 다른 기울기를 가진 곡선이다. 기울기가 다르다는 것은 다른 PCR 증폭효율임을 의미한다. 곡선의 기울기가 다른 곡선들처럼 가파르지 않다면 효율이 낮음을 의미한다. 동일한 효율로 DNA가 증폭되지 않기 때문에 곡선이 늦게 나타나고 Cq값은 더 높게 된다. 초기 시료가 더 적었던 것으로 보이며 잘못된 정량을 하게 된다.
저해에 대해 더 이야기하겠다.
오른쪽 곡선의 형태를 보면, 증폭곡선의 처음 부분은 정상이지만 plateau phase로 진입하지 않고 직선형 증가 곡선 형태가 된다. 한쪽 primer의 증폭은 끝났으나, 과하게 첨가된 다른 primer에 의해 한 쪽strand이 계속 증폭이 되기 때문에 이런 비대칭적 증폭이 나타난다. 일반적으로 mastermix를 만들어 진행했다면 모든 샘플에서 동일한 현상이 일어날 것이다. Cq값을 정하는 초기 증폭곡선의 형태가 정상이었다면 정량은 방해 받지 않고 곡선을 사용할 수 있다.

Day 기반 qPCR 반응을 할 때 template control이 없는 반응에서도 증폭 증가가 관찰될 수 있다.
Mastermix가 DNA로 오염된 게 아니라면 아마도 primer dimer 때문이다. Primer dimer는 primer에 의해 형성되는 비특이적 산물이다. 샘플에 target DNA가 없거나 매우 적다면 충분한 target DNA를 이용했을 때보다 비특이적 산물이 더 형성될 것이다. Dye를 이용한 qPCR반응에서는 melting curve를 이용해 primer dimer를 확인할 수 있다. DNA의 melting temperature를 통해 다른 PCR산물의 함유 여부를 확인할 수 있다. Primer dimer는 PCR 반응으로 증폭된 산물보다 짧기 때문에 낮은 melting temperature를 갖는다. Positive sample에서 한 개 이상의 peak가 나타난 것은 한 개 이상의 PCR산물을 의미한다. negative control은 약 74℃의 melting temperature에서 강한 peak를 갖고 positive sample은 74℃에서는 작은 peak를 갖고 80℃쯤에서 강한 peak를 갖는다. 실제로 primer dimer는 positive sample에서 형광강도에 영향을 미친다. Primer dimer로 인해 증폭곡선이 더 초기 Cq 값을 나타낼 수도 있다. 이런 증폭곡선에서 나온 Cq 값을 정량에 사용하는 것은 권장하지 않으며 이 실험은 낮은 농도의 target DNA를 측정할 수 있을 만큼 민감도도 충분하지도 않다.

Dye이용 실험에서는 dye가 primer dimer에 껴들어가 형광강도에 영향을 미치기 때문에 문제가 된다. 이로 인해 저농도 샘플의 Cq값이 예상보다 더 높게 나올 수 있다. Serial dilution으로 작성된 standard curve의 저농도 값은 선형에서 벗어나 정확한 정량 값을 줄 수 없다. 기준점이 거의 일치하는 직선 그래프에서 추정된 효율을 보면 100%이상임을 볼 수 있다. 효율이 100% 이상이면 standard curve이 잘 맞는지 확인하고 primer dimer로 인한 문제가 없는지 확인하라. Standard curve의 linear range를 벗어난 샘플을 정량 하면 안 된다. 따라서 너무 낮은 농도의 기준점은 제거하여 직선에 잘 맞도록 만들어야 한다.

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Probe법 실험을 할 경우, dye 방법과 다른 양상을 볼 수 있다. Primer dimer는 probe에 의해 검출되지 않지만 너무 많은 양의 primer dimer는 정확한 target sequence 증폭 효율에 영향을 미친다. Target 증폭과 primer dimer 형성 사이에 경쟁이 생긴다. 증폭곡선이 늦게 나타나거나 나타나지 않을 수도 있고 이것은 실제 샘플내 target DNA 양보다 더 적거나 없는 것처럼 보여주는 잘못된 정량 결과를 나타낼 수도 있다. Standard curve에서 낮은 범위의 기준점을 벗어난 값을 얻을 수도 있고 이 범위 내 있는 샘플은 정량 범위를 벗어 날 수도 있기 때문에 주의 해야 한다. Probe법 실험을 할 경우, 샘플이 primer dimer를 포함하는지 아닌지 확인하는 것이 어렵다. 일반적으로 probe를 이용하는 qPCR은 melting curve와 같은 옵션이 없다.

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그래서, TATAA에서는 BOXTO라는 DNA binding dye를 개발했다. BOXTO는 melting curve 분석시 형광을 측정하는 dye로 FAM-labelled probes와 함께 사용 가능하다. BOXTO는 FAM과 다른 형광 특징을 갖고 있어 JOE나 VIC channel 같은 다른 channel에서 분석된다. 따라서 FAM-channel에서 이뤄지는 정량에 영향을 끼치지 않는다. Dye는 master mix에 혼합시켜 사용하며, PCR 반응 후 melting시 형광 값을 분석 한다. Probe는 NTC에서 threshold를 넘지 못하는 red curve로 나타나는 dimer를 검출하지 않는다. 그러나 JOE나 VIC-channel에서 측정된 meliting curve에서는 이 반응 peak를 확인할 수 있다. Blue curve인 positive sample는 primer dimer를 포함하지 않고 있고, 좋은 결과이다.

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Melting curve에서 여러 개의 peak나 새로운 peak이 나타난다면 PCR산물을 gel에 전기영동 해 보길 바란다. 특이적 증폭인지 아니면 비특이적 증폭산물에 의한 간섭인지 확인 할 수 있다. 이 경우 TATAA에서는 최상의 조합을 찾기 위해 여러 개의 새로운 primer 쌍으로 분석한다. 몇몇 lane에서는 여러 개의 비특이적 증폭산물(longer bands)과 primer dimer(shorter bands)들을 확인 할 수 있다. 여러 개의 band가 증폭되는 primer 쌍은 제외 시킨다.

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Annealing temperature 조절을 통해 비특이적 증폭산물을 줄이고 높은 효율을 얻을 수 있다. 몇몇 qPCR 기기는 gradient PCR 반응으로 1회 PCR반응시 다양한 annealing temperature를 적용하여 분석할 수 있다. 그렇지 않다면, 다른 annealing temperature를 적용하는 여러 반응을 통해 비교할 수 있다. 여기에선 65℃~55℃의 annealing temperature로 실험했다. 64℃나 65℃와 같이 온도가 너무 높을 경우 전혀 증폭이 일어나지 않았다. 온도가 내려감에 따라 증폭 효율이 상승했다. 비특이적 증폭을 줄이기 위해서는 높은 효율이 유지되는 높은 온도를 선택하는 것이 좋다. 이 경우엔 59℃가 가장 적합하다.

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Inhibition과 어떻게 inhibition을 확인하는지 발표하겠다.

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Inhibitor는 효소반응을 방해하는 요소로 샘플(biological sample)에 존재하거나 추출과정에 발생한다. RT와 qPCR 실험에 모두 영향을 미칠 수 있다. 때론 inhibition이 너무 심해 결과가 전혀 나오지 않거나 반응 효율이 낮게 나올 수도 있다. 확인하는 것이 더 어렵지만 주의하지 않으면 잘못된 정량 결과를 얻을 수 있다.
Inhibition을 확인하는 몇 가지 방법
샘플(biological sample)을 serial dilution하여 증폭곡선의 기울기로 PCR 효율 측정
control이나 spike의 증폭 확인

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샘플(biological sample)을 serial dilution하면 직선형(linear range)의 결과를 얻을 수 있다. 만약 직선형(linear range)이 아니라면 첫 번째 curve가 기대했던 것보다 다음 희석액(curve)에 더 가깝다면 저해(inhibition)되었을 수 있다. Inhibition이 희석으로 해결 될 수 있다면 샘플을 충분히 희석해서 분석합니다. 그러나 샘플의 농도가 너무 낮거나 적을 경우 이 방법은 가능하지 않다.

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만약 PCR 반응이 저해된다면 증폭곡선의 기울기가 다르다. 이것은 눈으로 확인 가능할 때도 있다. 다양한 형태와 기울기를 가진 곡선이 있다.
잘못된 기울기를 갖는 곡선은 더 높은 Cq값을 줘 정량이 정확하지 않기 때문에 제거해야 한다.

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Spike라는 증폭 control을 이용하면 RT와 qRT 반응에서의 inhibition를 확인할 수 있다. Spike라고 하는 RNA 또는 DNA template를 샘플에 넣는다. RT 과정의 inhibition을 테스트하려면 RT전 추출한 샘플에 RNA-spike를 넣는다. qPCR assay inhibition을 테스트 할 땐, qPCR 반응 전 DNA-spike를 첨가 한다. 동시에 같은 농도의 spike를 control이나 물에 넣어 주어야 한다. qPCR 후, 샘플에 첨가했던 spike의 Cq값과 control이나 물에 첨가했던 spike의 Cq 값을 비교한다. 샘플내 spike의 Cq값이 control에서의 Cq값보다 높다면 저해 작용이 있는 것이다. TATAA Biocenter에서 Spike 실험 디자인이 제공이 가능하다. 또한 판매되고 있는 다양한 생물체의 reference RNA, cDNA와 genomic DNA를 이용하면 실험 결과를 높일 수 있다.

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RNA와 RT관해서 얘기하겠다

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DNA보다 RNA는 더 쉽게 손상되고 변형된다. RNA가 분해됐다면 RNA정량에 영향을 미친다. RNA는 열, UV-light나 다양한 화학물질이나 물리적 요인에 의해 분해될 수 있다. RNase와 같은 효소는 RNA를 빠르게 분해한다. qPCR로 RNA를 분석할 때, RNA를 분해시킬 수 있는 과정은 피하고 분석 전 RNA 품질을 체크하는 것이 매우 중요하다.

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RNA integrity를 체크하는 한 방법은 크기에 따라 RNA를 분리하는 것이다. 예를 들면, BioRad의 Experion system 또는 Agilent Technologie의 Bioanalyzer 나 ScreenTape으로 분석한다. 고품질 RNA는 18S와 28S ribosomal RNA가 2개의 뚜렷한 band나 electropherogram에서의 2개의 뚜렷한peak로 나타난다. 분해된 ribosomal RNA는 gel 상에서 smear하게 나타나고 electropherogram에서는 넓고 빠르게 이동한 peak로 나타난다.

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분석에서 RQI나 RIN 값과 같은 RNA 분해를 평가할 수 있는 값을 얻을 수 있다. RQI나 RIN 값이 높으면 고품질 RNA이며, 값이 낮으면 분해된 샘플이다. 이 방법의 단점은 대부분의 ribosomal RNA의 분해를 설명하는 것으로 mRNA의 분해와는 약간 다를 수 있다는 점이다. 그러나, 추정치로는 적용 할 수 있는 유용한 방법이다.

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mRNA level에서 RNA integrity를 평가할 수 있는 다른 방법이다. 이 방법은 3'/5' assay이다. oligo(dT) primer로 RNA의 poly A-tail부터 RT 한다. 동일한 transcript의 3'말단에 가까운 단편과 5' 말단에 가까운 단편을 증폭하도록 하여 PCR 실험을 한다. 선택적으로 transcript의 중간에 세 번째 단편을 증폭한다. 만약 mRNA가 온전하다면, 세 개의 실험에서 동일한 양이 증폭되어야 한다. 만약 일부 mRNA가 분해되었다면, 온전한 mRNA만 full length transcript를 생산하여 5' assay에 대한 template로 반응 할 수 있다. 5'/3' expression ratio는 온전한 mRNA부분을 반영한다. 3'/5' assay는 주로 화학적 분해에 의해 일어난 RNA 확인에 적합하다.

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RT 반응에서 저해와 어떻게 평가 할 수 있게 언급했다. 매우 적은 샘플과 낮은 농도의 샘플을 분석할 때 주의사항이다. 매우 낮은 농도의 샘플은 검출이 어렵다. Takara의 EASY Dilution buffer를 이용하면 중요한 샘플의 손실을 줄이면서 이런 문제의 발생을 줄일 수 있다. 이 그래프들은 serial dilution을 통해500~0.16ng RNA를 비교한 것이다. 왼쪽 그래프는 물로 희석한RNA이고, 오른쪽은 EASY Dilution buffer로 희석한 RNA이다. 물로 희석한 경우, 낮은 농도의 샘플들은 더 넓게 퍼진 결과를 보이고 있는데 이 부분은 primer dimer가 증폭 시그널에 영향을 미치는 지역에 들어간다. EASY Dilution Buffer 이용 경우에는 높은 linearity와 낮은 농도에서도 높은 재현성을 보인다.

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요약하면, 증폭곡선의 형태를 주의 깊게 보고 outliers를 확인해야 한다.
probe based 와 dye based assay, 모두 primer dimer에 의한 영향이 있는지 확인해야 한다.
Annealing temperature를 조절하여 비특이적 산물을 감소시키고 최고의 증폭 효율 만들어라. 샘플내 inhibitor가 포함되어 있는지 확인하고 고품질의 RNA를 이용해라.
마지막으로, 낮은 농도 샘플은 Takara의 EASY Dilution Buffer를 사용해라.