
Adeno-Associated Virus (AAV)´Â
Parvovirus °úÀÇ
Dependovirus ¼Ó¿¡ Æ÷ÇԵǴ non-envelope ¹ÙÀÌ·¯½ºÀÌ´Ù. AAV´Â »ç¶÷¿¡°Ô´Â ¸é¿ª¿ø¼ºÀÌ ¾ø´Â °ÍÀ¸·Î ¾Ë·ÁÁ® ÀÖÀ¸¸ç,
adenovirus
¶Ç´Â herpesvirus¿Í °°Àº helper virus Á¸Àç½Ã¿¡¸¸ Áõ½ÄÀÌ °¡´ÉÇÏ´Ù.
AAVÀÇ genomeÀº ¼±ÇüÀÇ single-strand DNA·Î ±æÀÌ´Â ¾à 4.7kbÀÌ´Ù. AAV genomeÀÇ ¾ç ¸»´Ü¿¡´Â inverted terminal repeats (ITRs)·Î ºÒ¸®´Â hairpin ±¸Á¶°¡ Á¸ÀçÇÑ´Ù.
ITRÀº AAV genomeÀÇ º¹Á¦¿Í AAV particleÀÇ packaging¿¡ °ü¿©ÇÑ´Ù.
AAV´Â 100°³ ÀÌ»óÀÇ serotypeÀÌ Á¸ÀçÇϸç, serotype¿¡ µû¶ó Á¾ ¹× Á¶Á÷¿¡ ´ëÇÑ °¨¿° ƯÀ̼º ¹× Ư¡ÀÌ ´Ù¸£´Ù. ´ÙÄ«¶ó¹ÙÀÌ¿À´Â AAV ¿¬±¸¿¡ °¡Àå ÀϹÝÀûÀ¸·Î »ç¿ëµÇ´Â
4°³ÀÇ serotype (AAV1, AAV2, AAV5, AAV6)¿¡ ´ëÇÑ Á¦Ç°À» Á¦°øÇϰí ÀÖ´Ù. AAV2´Â AAV¸¦ Ȱ¿ëÇÑ ¿¬±¸ (¿¹; À¯ÀüÀÚ Ä¡·áÁ¦)¿¡ °¡Àå ¸¹ÀÌ »ç¿ëµÇ¸ç ´Ù¾çÇÑ Á¾°ú Á¶Á÷¿¡ ´ëÇØ °¨¿°´É·ÂÀ»
°¡Áö´Â Ư¡ÀÌ ÀÖ´Ù. ¹Ý¸é, AAV1, AAV5, AAV6Àº ³ôÀº Á¶Á÷°¨¿° ƯÀ̼ºÀ» °¡Áö°í ÀÖ´Ù. AAV1Àº ±ÙÀ°°ú °£, È£Èí±â, Á߾ӽŰæ°è¿¡, AAV5´Â Á߾ӽŰæ°è, °£, ¸Á¸·¿¡,
AAV6´Â ½ÉÀå, ±ÙÀ°, °£¿¡ °¨¿°¼ºÀÌ
³ôÀº °ÍÀ¸·Î ¾Ë·ÁÁ³´Ù. (Ç¥ 1. ÂüÁ¶)
Adeno-associated virus (AAV)´Â ¼¼Æ÷¿Í Á¶Á÷¿¡ ´ëÇØ À¯ÀüÀÚ µµÀÔ È¿À²ÀÌ ³ô¾Æ, À¯ÀüÀÚµµÀÔÀÇ µµ±¸ ¶Ç´Â À¯ÀüÀÚÄ¡·áÀÇ µµ±¸·Î »ç¿ëµÇ¸ç, Adenovirus, Retrovirus,
Lentivirusº¸´Ù ¾ÈÀüÇÏ´Ù°í ¾Ë·ÁÁ®ÀÖ´Ù. AAV´Â ºÐ¿¼¼Æ÷¿Í ºñºÐ¿¼¼Æ÷¿¡ ´ëÇØ ¸ðµÎ °¨¿° °¡´ÉÇϸç, ƯÈ÷, ºñºÐ¿¼¼Æ÷¿¡¼´Â Àå±â°£ À¯ÀüÀÚ¹ßÇöÀÌ °¡´ÉÇÏ´Ù.
Serotype |
ÁÖ¿ä °¨¿° Á¶Á÷ |
AAV1 |
±ÙÀ°, °£, ±âµµ, ÁßÃß ½Å°æ°è |
AAV2 |
±¤¹üÀ§ÇÑ ¼¼Æ÷¡¤Á¶Á÷ |
AAV5 |
ÁßÃß ½Å°æ°è, °£, ¸Á¸· |
AAV6 |
½ÉÀå, ±ÙÀ°, °£ |
Ç¥ 1. AAVÀÇ serotype¿¡ µû¸¥ ÁÖ¿ä °¨¿° Á¶Á÷
¡¼Âü°í¹®Ç塽
-
J Nippon Med Sch. 2012;79(6):394-402.
-
Virol J. 2013 Mar 6;10:74
- AAVº¤ÅÍÀÇ °³¹ß°ú À¯ÀüÀÚ Ä¡·á¿¡ ÀÀ¿ë: ´Ü¹éÁú ÇÙ»ê È¿¼Ò Vol.52 No.10 (2007) 1288-1293
¡Ø À¯ÀüÀÚ µµÀÔÈ¿À²Àº °¢ ½ÇÇèÁ¶°Ç¿¡ µû¶ó ´Þ¶óÁú ¼ö ÀÖÀ¸¹Ç·Î °ü·Ã¹®ÇåÀ» ÂüÁ¶Çϱ⠹ٶø´Ï´Ù.
AAVÀÇ Æ¯Â¡
- AAV vector´Â ¼÷ÁÖ genomeÀ¸·Î »ðÀÔ (integration) µÇÁö ¾ÊÀ½
- ºÐ¿¼¼Æ÷³ª ºñºÐ¿¼¼Æ÷ ¸ðµÎ¿¡ Àû¿ë °¡´É
- ºñºÐ¿¼¼Æ÷¿¡¼´Â Àå±â°£ À¯ÀüÀÚ ¹ßÇö °¡´É
- ³·Àº ¸é¿ª¿ø¼ºÀ¸·Î in-vivo À¯ÀüÀÚ µµÀÔ ½ÇÇè¿¡ ÃÖÀû
´ÙÄ«¶ó¿¡¼´Â
Serotype 1, 2, 5, 6ÀÇ AAV¸¦ helper virus¾øÀÌ ¾ÈÀüÇÏ°Ô Á¦ÀÛÇϱâ À§ÇÑ AAVpro¢ç Helper Free System°ú ÇÔ²² AAVpro¢ç
CRISPR/Cas9, Tet-One ½Ã½ºÅÛ µî
´Ù¾çÇÑ AAV ½Ã½ºÅÛÀ» Á¦°øÇϰí ÀÖ´Ù. ¶ÇÇÑ, AAVÀÇ ¿ª°¡ Çâ»óÀ» À§ÇÑ Àü¿ë Transfection ½Ã¾à°ú Packaging cell line, packaging cell lineÀ¸·ÎºÎÅÍ
AAV¸¦ È¿À²ÀûÀ¸·Î ÃßÃâÇϱâ À§ÇÑ AAVpro¢ç Extraction Solution, °í¼øµµ AAV Á¤Á¦¸¦ À§ÇÑ AAVpro¢ç Purification Kit (All serotype, AAV2), ºü¸£°í °£ÆíÇÏ°Ô AAVÀÇ ¿ª°¡ ÃøÁ¤À» À§ÇÑ
Real Time PCR ¹æ½ÄÀÇ AAVpro¢ç Titration Kit µî AAV ½ÇÇè¿¡ ÇÊ¿äÇÑ ´Ù¾çÇÑ Á¦Ç°À» °ø±ÞÇϰí ÀÖ´Ù.
ÀÌ·¯ÇÑ ´ÙÄ«¶óÀÇ AAVpro¢ç Á¦Ç°À» ÀÌ¿ëÇϸé, È¿À²ÀûÀÎ transductionÀ» À§ÇÑ AAV¸¦ °í¿ª°¡·Î »ý»ê, ÃßÃâ, Á¤Á¦ ¹× titration ÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù. AAVpro¢ç ½Ã½ºÅÛÀ¸·Î Á¦ÀÛµÈ AAV´Â µ¿¹°
¼¼Æ÷³ª °¢°¢ÀÇ µ¿¹°°³Ã¼ÀÇ À¯ÀüÀÚ µµÀÔ (
in vivo transduction)¿¡ ÀÌ¿ëÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù.
±×¸² 1. Workflow of AAV
Takara Adeno-Associated Virus °ü·ÃÁ¦Ç°
AAVpro¢ç ½Ã¸®Áî
1. Helper virus¾øÀÌ ¾ÈÀüÇÏ°Ô °í¿ª°¡ÀÇ AAV Á¦ÀÛ
AAVpro¢ç Helper Free System (AAV1, AAV2, AAV5, AAV6) (Code 6230 ¿Ü)
- Helper virus¸¦ »ç¿ëÇÏÁö ¾Ê°í, ¾ÈÀüÇÏ°Ô AAV1, 2, 5, 6 Á¦ÀÛ (Helper Free System)
- AAV2 systemÀº hsa-miR-342 žÀçÇÑ vector »ç¿ëÀ¸·Î °í¿ª°¡ ¹ÙÀÌ·¯½º Á¦ÀÛ °¡´É
- µ¶ÀÚÀûÀÎ AAVpro¢ç Extraction SolutionÀ» ÀÌ¿ëÇÑ È¿À²ÀûÀÌ°í °£ÆíÇÑ AAV vector ÃßÃâ
- ´Ù¾çÇÑ Application Àû¿ë: CRISPR/Cas9, Tet-Inducible, CRE Recombinase system Á¦°ø
±×¸² 2. Human miRNA-342 (miR-342)°¡ AAV2 ¿ª°¡ Çâ»ó¿¡ ¹ÌÄ¡´Â È¿°ú. HEK293 ¼¼Æ÷¿¡¼ »ý»êµÈ AAVÀÇ ¿ª°¡¸¦ Real Time PCR (total vector genome; vg)·Î
ÃøÁ¤ÇÑ °á°ú, human miR-342°¡ ¹ßÇöµÇ´Â ½Ã½ºÅÛ¿¡¼ »ý»êµÈ AAVÀÇ ¿ª°¡°¡ ¾à 2¹è°¡·® ³ô¾Ò´Ù.
2. AAV »ý»ê¿¡ ÃÖÀûÈµÈ Transfection Reagent
TransIT-VirusGEN¢ç (Code MIR 6700)
- ³ôÀº Ȱ¼ºÀ» °¡Áö´Â °íǰÁúÀÇ Adeno associated virus (AAV) »ý»ê
- Transfection reagent º¯°æÀ¸·Î AAV titer ÃÖ´ë 2¹è Áõ°¡ °¡´É
- HEK293TÀÇ adherent ¶Ç´Â suspension ¼¼Æ÷ ¸ðµÎ Àû¿ë °¡´É
±×¸² 3. Functional titer°¡ ¶Ù¾î³ AAV »ý»ê. AAV »ý»êÀ» À§ÇØ adherent ¹× suspension cell¿¡ °¢°¢ÀÇ transfection reagent¸¦ »ç¿ëÇÏ¿© AAV packaging vector¸¦
transfection ÈÄ, »ý»êµÈ AAV¸¦ HT1080¼¼Æ÷¿¡ °¨¿°½ÃÄ×´Ù. 48½Ã°£ ÈÄ GFP¹ßÇöÀ» À¯¼¼Æ÷ÃøÁ¤±â·Î ÃøÁ¤ (n=3)ÇÏ¿© AAVÀÇ functional titer¸¦ ºñ±³Çغ» °á°ú,
TransIT-VirusGEN¢ç¸¦
»ç¿ëÇÏ¿© »ý»êµÈ AAV°¡ °¡Àå ³ôÀº functional titer¸¦ ³ªÅ¸³»¾ú´Ù.
3. AAV »ý»ê¿¡ ÃÖÀûÈµÈ Packaging cell
AAVpro¢ç 293T Cell Line (Code 632273)
±×¸² 4. ³ôÀº titerÀÇ AAV¸¦ »ý»êÇÏ´Â AAVpro¢ç 293T cell line. 3Á¾·ùÀÇ packaing cell lineÀ» »ç¿ëÇÏ¿© AAV2¸¦ Á¦ÀÛ (AAVpro¢ç Helper Free System (AAV2) »ç¿ë)ÇÑ °á°ú, AAVpro¢ç 293T Cell Line¿¡¼ °¡Àå ³ôÀº ¿ª°¡ÀÇ AAV2°¡ »ý»êµÊÀ» È®ÀÎÇÏ¿´´Ù.
4. Packaging cell·ÎºÎÅÍ °£ÆíÇϰí È¿À²ÀûÀÎ AAV ÃßÃâ
AAVpro¢ç Extraction Solution (Code 6235)
ÀϹÝÀûÀ¸·Î AAV¸¦ packaging cell·ÎºÎÅÍ ÃßÃâÇϱâ À§Çؼ´Â »ç¿ëÇÏ´Â freeze/thaw, sonicationµî Ưº°ÇÑ Àåºñ°¡ ÇÊ¿äÇÏ°í ½Ã°£ÀÌ ¸¹ÀÌ ¼Ò¿äµÇ´Â ´ÜÁ¡ÀÌ ÀÖ´Ù. ÇÏÁö¸¸,
AAVpro¢ç Extraction Solution (Code 6235)Àº °£ÆíÇϰí
È¿À²ÀûÀ¸·Î AAV¸¦ ÃßÃâÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù.
- ±âÁ¸ÀÇ freeze-thaw ¹æ¹ý¿¡ ºñÇØ ÃÖ¼Ò 3¹è ÀÌ»ó ³ôÀº ȸ¼öÀ²
- Packaging cellÀ¯·¡ DNA ¹× ´Ü¹éÁú ¿À¿° ÃÖ¼ÒÈ
- ¸ñÀû¼¼Æ÷ °¨¿° ¶Ç´Â In-vivo ½ÇÇè*À» À§ÇÑ AAV Á¤Á¦¿¡ ÀûÇÕ
*in vivo À¯ÀüÀÚ µµÀÔÀ» À§Çؼ´Â AAVpro¢ç Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666) ¶Ç´Â AAVpro¢ç Purification Kit (AAV2) (Code 6232)
̵̧
±×¸² 5. AAVÀÇ ÃßÃâÈ¿À² ºñ±³. AAVpro¢ç Extraction Solution (³²»ö)°ú freeze-thaw ¹æ¹ý (ºÐÈ«»ö)À» ÀÌ¿ëÇØ ÃßÃâÇÑ AAV ÀÇ ¿ª°¡¸¦ Real Time PCR·Î ÃøÁ¤.
´Ù¾çÇÑ serotype¿¡¼ AAVpro¢ç Extraction Solution¸¦ »ç¿ëÇÑ AAVÀÇ ÃßÃâ È¿À²ÀÌ ³ôÀº°ÍÀ¸·Î È®ÀεǾú´Ù.
5. Ãʰí¼Ó ¿ø½ÉºÐ¸®±â ¾øÀÌ, ºü¸£°í °£ÆíÇÏ°Ô AAV Á¤Á¦
AAVpro¢ç Purification Kit (All serotypes, AAV2)
³ôÀº È¿À²·Î µ¿¹° ¹× ¼¼Æ÷¿¡ À¯ÀüÀÚ¸¦ µµÀÔÇϱâ À§Çؼ´Â AAVÀÇ ¸é¿ª ¹ÝÀÀÀ» ÀÏÀ¸Å°´Â ºÒ¼ø¹°ÀÇ Á¦°Å°¡ ¹«¾ùº¸´Ù Áß¿äÇÏ´Ù. ÀϹÝÀûÀ¸·Î ¾²ÀÌ´Â Ãʰí¼Ó¿ø½ÉºÐ¸®±â¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ ¹æ¹ýÀº ½Ã°£ÀÌ ¸¹ÀÌ ¼Ò¿äµÇ°í, ¼öÀ²À» ³ôÀ̱â À§Çؼ Á¤¹ÐÇÑ Á¶ÀÛÀÌ ÇÊ¿äÇÏ´Ù. AAVpro¢ç Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666) ¶Ç´Â AAVpro¢ç Purification Kit (AAV2) (Code 6232)¸¦ ÀÌ¿ëÇÏ¸é °£´ÜÇÏ°í ºü¸£°Ô (4½Ã°£ À̳») AAV¸¦ °í¼øµµ·Î Á¤Á¦ÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù.
- ºü¸£°í °£ÆíÇÑ AAVÀÇ Á¤Á¦ - Ultracentrifuge »ç¿ë ¾øÀÌ, 4½Ã°£¸¸¿¡ Á¤Á¦ ¿Ï·á
- Á¤Á¦µÈ AAV in vivo Àû¿ë °¡´É - ¸¶¿ì½º brain À¯ÀüÀÚ µµÀÔ ¿¹ (±¹¹®/¿µ¹®)
- µ¶ÀÚÀûÀÎ AAV ÃßÃâ¹ý »ç¿ë, freeze/thaw, sonication ºÒÇÊ¿ä (ƯÇã Ãâ¿ø Áß)
- AAVÀÇ serotype¿¡ µû¶ó ¼±ÅÃÇØ¼ »ç¿ë - AAV2 Àü¿ë ¶Ç´Â All serotype ¿ë
- Packaging cell line¿¡¼ AAV ÃßÃâºÎÅÍ Á¤Á¦±îÁö ¸ðµç ±¸¼ºÇ° Æ÷ÇÔ
±×¸² 6. AAVpro¢ç Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666)À¸·Î Á¤Á¦µÈ ´Ù¾çÇÑ serotypeÀÇ AAVÀÇ °¨¿°´É·Â È®ÀÎ
±×¸² 7. AAVpro¢ç Purification Kit (AAV2) (Code 6232) ÀÇ Á¤Á¦È¿À² (A)°ú ¼øµµ (B) ºñ±³. AAVpro¢ç Purification Kit (AAV2)°ú B»ç, C»çÀÇ purification kitÀ»
»ç¿ëÇÏ¿© AAV2ÀÇ Á¤Á¦È¿À², ¼øµµ¸¦ ºñ±³ÇÏ¿´´Ù. Á¤Á¦µÈ AAV2¸¦ qPCR·Î Á¤·®ÇÏ¿© Á¤Á¦È¿À² (A)°ú, SDS-PAGE·Î ¼øµµ (B)¸¦ ºñ±³Çغ» °á°ú AAVpro¢ç Purification Kit (AAV2)ÀÇ Á¤Á¦È¿À²°ú
¼øµµ°¡ ³ôÀº °ÍÀÌ È®ÀεǾú´Ù.
[AAVpro¢ç Purification Kit (AAV2) (Code 6232) »ç¿ë¹æ¹ý º¸±â]
6. qPCRÀ» ÀÌ¿ëÇÑ ºü¸£°í Á¤È®ÇÑ AAV ¿ª°¡ ÃøÁ¤
AAVpro¢ç Titration Kit (for Real Time PCR) Ver2. (Code 6233)
- ITR (Inverted Terminal Repeat)*¸¦ Ÿ°ÙÇϹǷÎ, vector ¼¿À̳ª serotype¿¡ °ü°è¾øÀÌ Àû¿ë °¡´É
- ±âÁ¸ÀÇ DNA blot ¶Ç´Â ELISA ¹æ¹ýº¸´Ù Á¤È®ÇÑ Á¤·®
* º» Á¦Ç°Àº AAV2 À¯·¡ÇÑ ITRÀ» Ÿ°ÙÀ¸·Î Á¤·®ÇϹǷÎ, AAV2 À¯·¡ÀÇ ITRÀ» °¡Áø AAV¸é serotype¿¡ °ü°è¾øÀÌ »ç¿ë °¡´ÉÇÏ´Ù.
±×¸² 8. ITR°ú CMV promoter regionÀ» qPCR ¹æ½ÄÀ¸·Î AAV ¿ª°¡ ÃøÁ¤. ITR°ú CMV promoter¸¦ Ÿ°ÙÀ¸·Î ÇÑ qPCR °á°ú´Â °ÅÀÇ µ¿ÀÏÇÑ °á°ú°ªÀ» ³ªÅ¸³»¾ú´Ù.
7. º¹ÀâÇÑ °úÁ¤¾øÀÌ AAV¸¦ È¿À²ÀûÀ¸·Î ³óÃà
AAVpro¢ç Concentrator (Code 6674)
- ¹è¾ç »óÃþ¾×ÀÇ Ç÷û (Serum) À¯¹«¿¡ °ü°è¾øÀÌ ³óÃà °¡´É
- º¹ÀâÇÑ °úÁ¤¾øÀÌ ´Ù¾çÇÑ Serotype¿¡ Àû¿ë °¡´É
±×¸² 9. Serum free ¹è¾ç »óÃþ¾×ÀÇ AAV ³óÃà ¿¹.
AAV1 producing cellÀÇ ¹è¾ç»óÃþ¾× 40 §¢¸¦ 200 §¡·Î ³óÃàÇÏ¿© ¿ª°¡ ÃøÁ¤ÇÑ °á°ú, §¢´ç ¾à 95¹è ³óÃàÇÒ ¼ö ÀÖ¾ú´Ù.