T 림프구 (T cell)는 항원 특이적 면역반응에 매우 중요한 역할을 하는 세포로 활성화 된 후 감염세포 또는 종양세포를 인식하여 제거하는 기능을 한다. T cell은 항암치료를 위해 혈액으로부터 손쉽게 분리하여 ex vivo에서 배양할 수 있지만, 유전적으로 조작하고, 효율적으로 확대배양하여 치료에 필요한 양의 세포를 얻기는 쉽지 않다.

In vitro T-cell 확대배양은 growth factor interleukin 2 (IL-2)와 anti-CD3 mAb (OKT3 clone)을 첨가하여 확대배양 효율을 극대화시킬 수 있다. CD3 pathway의 활성화는 T cell이 IL-2 receptor의 stimulation에 반응하게 하여 proliferation을 유발하는 원리로 확대배양 효율이 높아진다. 또한, Anti-CD3 Ab를 첨가하면 CD3 complex와 관련된 T cell 표면의 antigen receptor를 교란하여 antigen receptor를 활성화시킨다 (Tsoukas et al. 1985)
RetroNectin^®을 IL-2, anti-CD3 Ab와 함께 이용하면 naive CD8⁺ T cell의 확대배양 효율을 높여, 유전적으로 변형된 T cell의 확대배양 효율을 높이고, 이식 후 잔존율을 높인다고 보고된 바 있다 (Yu et al. 2008).
또한 RetroNecin^®은 VLA-4, LVA-5 자극을 통해 CD8⁺ T cell의 확대배양 효율을 향상시키고, effector의 기능성 및 in vivo memory formation율을 높여줄 수 있다고 알려진 바 있다 (Hosoi et al. 2014).

이처럼 RetroNectin^® Recombinant Human Fibronectin Fragment와 RetroNectin^® GMP grade를 사용하면 유전자 도입이 어려운 세포의 lentivirus 또는 retrovirus 도입효율을 높여 줄 뿐만 아니라, PBMC (Peripheral blood mononuclear cells)로부터 T cell 확대배양 효율을 향상시키고 Naive T cell 비율을 높일 수 있다.
본 페이지에서는 RetroNectin^®, GT-T551 T cell 배지, CultiLife™ 215 culture bag 및 anti-CD3 Ab를 이용한 T cell 확대배양 적용사례를 안내하고자 한다.

RetorNectin^® increases expansion and naive T cell fraction of PBMC
2명의 공여자에서 채취한 말초혈액으로부터 분리한 Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)를 anti-CD3 Ab와 단독으로 또는 RetroNectin^® 과 함께 배양한 후, T cell 확대배양 효율과 naive T cell 비율 (CD45RA, CCR7 발현율)을 확인하였다. 그 결과, RetroNectin^®을 함께 사용하였을 때 확대배양 효율이 향상되었고 naive T cell 비율도 높아진 T cell을 확보할 수 있었다.


그림 1. RetoNectin^®을 이용한 T cell을 확대배양 효율 비교
말초혈액에서 분리한 T cell을 anti-CD3 Ab (OKT3 clone), IL-2와 함께 자극, 10일간 확대배양한 결과, RetroNectin^®을 함께 사용하였을 때가 약 2배 이상 높은 naive T cell (CD45RA+/CCR7+ phenotype) 비율을 나타내었다.

Anti-CD3/IL-2 자극 시 RetroNectin^®을 함께 사용하면 T cell 확대배양 효율이 비약적으로 향상될 뿐만 아니라 naive T cell 비율도 높아 T cell을 이용한 다양한 치료법 연구 및 개발에 고품질의 T cell을 확보할 수 있는 장점이 있다.

Experimental timeline from PBMC isolation through T cell expansion
다카라에서는 아래와 같이 가스 투과성 culture bag을 이용한 배양 시스템에서 ‘RetroNectin^®의 co-stimulation을 이용한 T-cell 확대 배양법^※'을 추천하고 있다.

그림 2. RetroNectin^®, GT-T551 T cell 배지, CultiLife™ 215 bag, anti-CD3 mAb를 이용한 T cell expansion protocol

첫째날 (Day 0)
Step 1) CultiLife™ 215 Culture bag (Code FU0005)에 Anti-CD3 mAb GMP grade (Code T210)와 RetroNectin^®을 코팅 (Day 0)
- Anti-CD3 Ab (OKT3) (5 ㎍/㎖)와 RetroNectin^® (25 ㎍/㎖)이 포함된 PBS solution 30 ㎖를 CultiLife™ 215 Culture bag (Code FU0005)에 전량 첨가한다.
※ OKT3과 RetroNectin^®의 코팅에는 CultiLife™ 215을 사용하며, GT-T610 (CultiLife™ Eva) Culture bag (Code FU0010)은 코팅 목적으로 사용할 수 없다.
- 37℃, CO₂조건하에서 2 ~ 5 시간 동안 코팅 후 Culture bag 안의 용액을 전량 제거한다.
- PBS 30 ㎖를 이용하여 culture bag을 세 번 세척한다. (마지막 PBS는 세포 첨가 직전에 제거한다.)

Step 2) Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) 첨가
- PBMC 3 × 10⁷ cells를 0.5~5 %의 혈청 또는 혈장이 포함된 GT-T551 Culture medium (Code WK551S) 30~50 ㎖에 현탁한다.
※ GT-T551 media를 사용하는 경우, 일반적으로 0.5~1 %의 혈청 또는 혈장을 첨가한다.
- PBMC 현탁액에 IL-2를 첨가한다 (최종 배양액에 200 ~ 1,000 U/㎖ 농도로 첨가).
- Step (1)의 RetroNectin^®과 anti-CD3 Ab를 코팅한 CultiLife™ 215에 IL-2가 포함된 PBMC 현탁액을 전량 첨가한다.
- 최종 volume이 200~300 ㎖이 되도록 Culture bag에 media를 첨가한다.
- 37℃, 5% CO₂에서 배양한다.



Step 3) Passage (Day 4)
- CultiLife™ 215의 세포의 일부 또는 전량을 GT-T610 (CultiLife™ Eva)로 옮긴다
※ 배양된 PBMC는 RetroNectin^®에 의해 culture bag에 강하게 결합되어 있으므로, 아래의 그림과 같이 양손으로 앞, 뒤 약 50회 흔들어 세포를 culture bag에서 분리시킬 수 있다.



※ CultiLife™ 215 culture bag에서 세포가 분리되었는지 현미경으로 확인할 수 있다.
- 적정량의 IL-2 (200 ~ 1,000 U/㎖)가 포함된 배지를 첨가한다.
※ GT-T610 (CultiLife™ Eva) bag의 최대 volume은 1,000 ㎖이다.
- 37℃, 5% CO₂에서 배양한다.
- 세포 증식에 따라 적절히 배지를 첨가, passage하면서 GT-T610 (CultiLife™ Eva)의 수를 늘려 10~14일간 배양한다.

Step 4) Harvest (Day 10~14)
- GT-T610 (CultiLife™ Eva)에서 확대 배양된 PBMC 세포를 원심분리 등의 방법으로 회수한다.



※참고 자료

	Day 0	Day 4	Day 7	Day 10
PBMC number	3 x 107 cells
Culture volume	300 ㎖	500 ㎖ x 5*3	1,000 ㎖ x 5*4
Culture area	215 cm2*1	640 cm2*2 x 5
	CultiLife™ 215 x 1	GT-T610 (CultiLife™ Eva) x 5		Harvest

^*1 CultiLife™ 215의 배양 면적은 215 ㎝² 이다.
^*2 GT-T610 (CultiLife™ Eva)의 배양 면적은 640 ㎝² 이다.
^*3 Day 4의 세포 농도가 4 × 10⁵ cells/㎖ 미만일 경우 Day 5에 passage한다.
   Day 4에 세포 농도가 최소 5 × 10⁴ cells/㎖ 이상일 경우 passage한다.
^*4 이때는 세포 농도가 5 × 10⁵ cells/㎖ 이상일 경우 passage란다.

Code	제품명	용량
T100A	RetroNectin® (Recombinant Human Fibronectin Fragment)	0.5 ㎎ (0.5 ㎖)
T100B	RetroNectin® (Recombinant Human Fibronectin Fragment)	2.5 ㎎ (2.5 ㎖)
T201	RetroNectin® GMP grade	2.5 ㎎
FU0005	CultiLife™ 215 Culture bag	10 pcs
FU0010	GT-T610 (CultiLife™ Eva) Culture bag	10 pcs
WK552S	LymphoONE™ T-Cell Expansion Xeno-Free Medium, 1L Bottle＊	1,000 ㎖
WK551S	GT-T551 Culture medium, 1L Bottle	1,000 ㎖
T210	Anti-CD3 mAb GMP grade	1.0 ㎎/1.0 ㎖

^＊ LymphoONE™ T-Cell Expansion Xeno-Free Medium (Code WK552S)는 배지 성분의 최적화를 통해 혈청, 혈장을 첨가하지 않아도 기존제품인 GT-T551 Culture medium (Code WK551S)보다 T cell 증식율을 높인 제품입니다.