Q1. Multiplex PCR 시 가장 고려해야 할 요소는 무엇인가요?
Multiplex PCR에서는 사용하는 모든 primer가 타겟 DNA에 유사한 priming 효율을 가지는 것이 중요합니다. 따라서, 최적 annealing 온도가 비슷한 primer를 이용하는 것이 좋으며, primer를 디자인할 때는 아래의 사항을 주의 깊게 고려해야 합니다.

• 타겟 DNA 서열과의 상동성
• 길이
• GC 함량
• 농도
• Primer 상동성 : primer 내부 혹은 primer 간의 상동성이 없어야 합니다 (특히 3’ 말단).

Q2. Nested PCR이 무엇인가요?
Nested PCR은 PCR 효율을 높이기 위해 re-amplification 단계를 추가하는 방법입니다. 이 방법은 첫번째 PCR에서 증폭된 PCR 산물의 내부에 위치하는 새로운 primer (forward-nested (FN) 또는 reverse-nested (RN) primer)를 디자인하여 사용합니다. 이를 첫번째 PCR의 primer와 함께 사용할 수도 있습니다.

Nested PCR에서는 nested primer와 함께 첫번째 PCR 산물의 매우 소량을 주형으로 사용합니다.
이때 아래와 같은 방법으로 PCR 산물의 수율을 높일 수 있습니다.

• 첫번째 PCR에서 존재할 수 있는 extra band 제거
• 첫번째 PCR에서 흐리거나 보이지 않는 수준의 band가 강하게 형성되도록 진행

Nested PCR은 주형 DNA 서열의 complexity가 매우 낮기 때문에 첫번째 PCR 산물을 매우 소량만 주형으로 사용하는 것이 중요합니다. 이를 위해 첫번째 PCR 산물을 1/100로 희석하여 1 ㎕를 nested PCR의 주형으로 사용할 수 있으며 PCR cycle을 25~30까지 낮추는 방법도 고려해 볼 수 있습니다. Nested PCR의 최적의 조건은 여러 실험을 통해 검토하는 것이 좋습니다.

Q3. Touchdown PCR (TD-PCR)이 무엇이고, 언제 필요한가요?
PCR의 denaturation 단계에서 모든 DNA 분자는 단일 가닥이 됩니다. 이후 annealing 단계에서 온도가 내려가면 아래와 같이 세 종류의 duplex가 형성됩니다.

• Homoduplexes : 상보적인 서열을 가진 DNA들의 결합
• Heteroduplexes : 부분적으로 상보적인 서열을 가진 DNA들 간의 cross-hybridization
• primer와 주형 간의 duplexes

PCR의 정확도를 높이기 위해서는 PCR cycle의 초기에 온도를 높이는 방법 등으로 반응의 stringency를 높여 heteroduplex가 형성되는 것을 최소화해야 합니다. Touchdown PCR은 PCR cycle 마다 annealing temperature를 순차적으로 낮춰 반응의 특이성을 높이는 방법입니다. 초기 단계의 annealing 온도는 primer의 T_m 값보다 조금 높게 설정하고, 이후 cycle부터 순차적으로 primer의 T_m 값으로 계산된 온도까지 annealing 온도를 낮추는 방법으로 진행합니다 (Don 1991). 이러면 PCR 초반에 더 높은 annealing temperature를 사용하기 때문에 primer와 주형 간의 상보성이 가장 높은 증폭산물을 축적하게 되고, 이후 cycle에서 점점 온도를 낮춰 줌으로써 priming 효율을 높여 앞에서 증폭된 template을 추가로 증폭할 수 있습니다.

첫 5~10 cycle은 조금 더 높은 annealing 온도에서 진행하고, 점차적으로 온도를 최적 annealing 온도 또는 touchdown 온도까지 낮추는 것을 추천합니다.
예를 들어 primer의 T_m값이 68℃에서의 Touchdown PCR (TD-PCR)의 annealing 온도의 추천 조건은 아래와 같습니다.
- 72℃ 5 cycles 후,
- 70℃ 5 cycles 후,
- 68℃ 25 cycles

References
Don, R. H., et al. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl Acids Res. 19(14):4008 (1991).

Q4.Blunt-end PCR 산물의 TA-cloning은 어떻게 진행하나요?
High fidelity PCR 효소를 사용해 blunt-end의 PCR 산물이 형성됐다면 Taq polymerase (e.g. TaKaRa Taq™ (Code R001A))를 사용해 A-tailing 후 TA-cloning을 진행할 수 있습니다. 이때, 대략적인 실험법은 아래와 같습니다.

1. PCR 산물의 정제 : A-tailing 과정에서 이전 PCR에서 사용된 polymerase가 남아 있는 경우 proofreading 활성이 A-overhang을 분해할 수 있습니다. 따라서 PCR purification kit 또는 phenol extraction을 통해 DNA를 정제하는 과정이 필요합니다.

2. Taq DNA polymerase 반응액 준비

	Final concentration	Volume (㎕)
정제된 PCR 산물	0.15~1.5 pmol	Varies*
dATP (10 mM)	0.2 mM	1
PCR buffer with Mg2+ (x10)	1 x (1.5 mM MgCl2)	5
Taq DNA polymerase (5 U/㎕)	1 U	0.2
ddH2O		to 50 ㎕

^*A-tailing은 정확한 양의 PCR 산물을 사용할 때 최적의 효율을 보입니다. 이때, 추천하는 양은 PCR 산물의 100 bp 당 10~100 ng 입니다. 이는 0.15~1.5 pmol의 PCR 산물과 동일합니다 (아래 표 참고).

PCR 산물 크기	추천 PCR 산물의 양
100 bp	10~100 ng
250 bp	25~250 ng
1,000 bp	100~1,000 ng

3. 72℃에서 20분간 반응

3’ A-overhang은 시간이 지날수록 점차 분해되기 때문에, 최적의 ligation 효율을 위해서는 A-tailing 후 바로 TA-cloning을 진행하는 것을 추천합니다.
^* Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR^® (Code 6019)를 사용하면 PCR product의 A-tailing을 위한 시약부터 TA-cloning을 위한 vector (pMD20-T vector), cloning (Ligation Mighty Mix) 시약까지 제품을 준비할 수 있습니다.

Q5. A-overhang 또는 blunt end의 PCR 산물을 생성하는 효소에는 어떤 것들이 있나요?

• PrimeSTAR^® 시리즈, TaKaRa Ex Premier™
  3’->5’ exonuclease 활성을 가지고 있어 blunt end의 PCR 산물이 생성됩니다. 이러한 blunt end PCR 산물의 TA-cloning 시에는 Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR^® (Code 6019)를 blunt end vector에 cloning시에는 Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) (Code 6027)을 추천합니다.
• TaKaRa Taq™ 시리즈
  TaKaRa Taq™, TaKaRa EX Taq^®, TaKaRa LA Taq^®, EmeraldAmp^® 등의 효소는 3’ 말단에 A-overhang을 가진 PCR 산물을 생성합니다. 이러한 A-overhang을 가진 PCR 산물은 TA cloning 시에는 Mighty TA-cloning Kit (Code 6028)를 blunt end vector에 cloning 시에는 Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) (Code 6027)을 추천합니다.
• 다카라코리아에서 판매하는 모든 PCR 효소의 증폭산물
  일부 PCR 효소는 blunt end와 A-overhang PCR 산물을 모두 형성하는 경우도 있습니다.
  자세한 내용은 아래의 표에서 확인할 수 있습니다.

Polymerase	A-overhang	Blunt end
PrimeSTAR® HS DNA Polymerase		∨
PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase		∨
PrimeSTAR® Max DNA Polymerase		∨
TaKaRa Taq™ DNA polymerases	∨
TaKaRa EX Taq™ DNA polymerases	∨	∨
TaKaRa LA Taq™ DNA polymerases	∨	∨
Titanium® Taq DNA Polymerase	∨
Advantage® 2 Polymerase Mix	∨	∨
Advantage® GC 2 Polymerase Mix	∨	∨
Advantage® HF 2 Polymerase Mix	∨	∨
EmeraldAmp® GT PCR Master Mix	∨
SapphireAmp® Fast PCR Master Mix	∨	∨
High Yield PCR EcoDry™ Premix	∨
High Fidelity PCR EcoDry™ Premix	∨	∨
Terra™ PCR Direct Polymerase Mix	∨
SpeedSTAR™ HS DNA Polymerase	∨	∨
CloneAmp™ HiFi PCR Premix		∨
SeqAmp™ DNA Polymeras		∨
TaKaRa Z-Taq™ DNA Polymerase	∨	∨
PerfectShot™ Ex Taq™ (Loading dye mix)	∨	∨

Q6. High fidelity PCR 효소가 무엇인가요?
PCR 효소에서 높은 정확도 (high fidelity)는 주형을 정확하게 복제하는 능력을 의미합니다. Proofreading 활성을 가진 PCR 효소들은 3’->5’ exnuclease 활성을 통해 잘못된 nucleotide가 들어간 DNA를 교정합니다. 이를 통해 에러율이 낮은 정확한 PCR 산물을 합성할 수 있습니다.

High fidelity PCR 효소는 gene cloning, 단백질 발현, 단백질의 구조와 기능 연구, cDNA library 제작, NGS 등의 연구 분야에서 추천됩니다. 실험에 따른 추천 PCR 효소는 실험별 PCR 효소 선택하기에서 확인할 수 있습니다.

Q7. PCR 효소 간의 fidelity는 어떻게 비교하나요?
PCR 효소의 에러율은 여러 가지 방법을 통해 비교될 수 있습니다. 이에 가장 대표적인 방법으로 아래의 두가지 방법이 있습니다.

• Blue-White screening
  Phenotype의 변화를 확인하는 것으로 PCR 효소의 error율을 비교할 수 있습니다. Blue-White screening은 phenotype의 변화를 빠르고 간편하며 경제적으로 확인할 있어 널리 사용되는 실험입니다 (Kunkel and Tindall 1987).
  이 실험은 lacZα 유전자에 의해 β-galactosidase enzyme이 활성화되면 푸른색의 colony가 형성되는 것을 이용합니다. lacZα 유전자의 PCR 산물을 cloning 후 colony를 확인하게 되면, PCR 과정에서 error가 발생한 lacZα 유전자를 가진 colony는 하얀색을, 반대로 error가 발생하지 않은 lacZα 유전자를 가진 colony는 푸른색의 colony가 형성됩니다. 이를 통해 PCR 과정에서의 error율을 확인할 수 있습니다.
• Sequencing approach
  Sanger sequencing을 사용하면 PCR 후 각각의 colony에 error율을 확인할 수 있습니다. Blue-White screening은 PCR 효소의 정확도를 측정하는 매우 간단한 방법이지만 silent mutation은 감지할 수 없기 때문에 직접 sequencing을 하는 방법보다는 정확도가 떨어집니다. Sequencing을 사용하면 모든 종류의 mutation을 더욱 정확하게 감지하여 PCR 과정에서의 error율을 더욱 정확하게 확인할 수 있습니다.

References
Kunkel, T. A. and Tindall, K. R., Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry 27, 6008-6013 (1987).

Q8. 다카라코리아의 high fidelity PCR 효소인 PrimeSTAR®의 fidelity는 어떻게 측정되었나요?
PrimeSRAR^®의 fidelity는 PCR 후 제작된 colony의 sanger sequencing을 통해 측정되었습니다.

• Thermus thermophilusHB8 genomic DNA에서 임의로 10개의 GC-rich region을 증폭
• PCR 산물을 plasmid에 cloning
• 각각의 증폭산물들에 다수의 clone을 선별 후 PCR로 증폭된 inert의 sequencing.

PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase (Code R045A)와 PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase (Code R050A) 두 효소의 fidelity를 비교한 결과 PrimeSTA^R® Max DNA Polymerase는 Taq polymerase의 29배의 fidelity를 가지고 있고, PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase는 6.5배의 fidelity를 가지고 있었습니다.

Q9. Inosine을 포함한 primer를 사용할 때 주의할 사항은 무엇인가요?
Inosine이 포함된 primer는 TaKaRa Taq™ (Code R001A) 또는 TaKaRa Taq™ hot start version (Code R007A)와 같이 사용하는 것을 추천합니다. Inosine이 포함된 primer에 3’->5’ exonuclease 활성을 가진 PCR 효소 (e.g. PrimeSTAR^® HS DNA Polymerase, PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase, PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase, TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase, TaKaRa Ex Taq™ DNA Polymerase, Takara LA Taq™ DNA polymerases)를 사용하면 반응성이 현저히 떨어집니다.
다카라코리아에서는 degenerated PCR을 진행하는 경우 inosine을 포함한 primer 보다는 목적하는 위치에 A, T, G 또는 C 염기를 가진 degenerate primer의 mixture를 사용하는 것을 추천합니다.