Mir-X system을 이용한 microRNA & mRNA의 빠르고 정확한 정량

• 동일한 RNA 샘플에서 miRNA와 miRNA의 target 정량 가능
• 정량을 위한 완전한 system 제공 - cDNA 합성을 위한 kit와 qPCR kit 포함
• 간편한 single step cDNA 합성 프로세스 제공

조직이나 세포주에서 microRNA 발현 프로필을 밝히는 것은 어려운 과정이다. 이를 위해 Takara Bio에서는 민감도 높고 신뢰할 수 있으며 사용하기 쉬운 miRNA 정량화 시스템을 개발하였다. Mir-X™ miRNA qRT-PCR TB Green Kit (Code 638314 외)은 목적 miRNA의 발현량을 정확하게 측정하기 위해 first-strand cDNA 합성 및 정량 PCR (qPCR)을 모두 수행할 수 있도록 개발된 complete kit이다.

■ 간편하고 민감한 검출 가능
Poly(A) polymerase 와 SMART MMLV Reverse Transcriptase 효소의 최적화된 조합을 이용하여 간편한 single step 반응으로 RNA 샘플로부터 first-strand cDNA를 합성한다. 이 cDNA에서 목적 miRNA specific primer와 TB Green^® Advantage qPCR Premix를 이용하여 목적 miRNA를 증폭 및 정량하였다. miRNA의 목적 mRNA는 물론, 여러 개의 (multiple) miRNA를 모두 하나의 cDNA로부터 합성할 수도 있다. 이 system은 매우 민감한 검출이 가능하며, 최대 50 copies까지 검출 가능하다.


그림 1. Mir-X™ miRNA qRT-PCR TB Green Kit을 이용한 miRNA 정량 과정
Mir-X™ miRNA qRT-PCR TB Green Kit을 이용하면, single-step, single-tube 반응으로 first-strand cDNA를 합성한 후, 목적 miRNA specific primer와 TB Green^® Advantage qPCR Premix를 이용하여 목적 miRNA를 정량할 수 있다. 이 Mir-X™을 이용한 cDNA 합성은 RNA에 Poly(A) polymerase를 이용하여 poly(A) tail을 만들고, 변형시킨 (modified) oligo(dT) primer와 SMART^® MMLV Reverse Transcriptase를 이용하여 복제하는 과정으로 진행된다. 

■ 매우 특이성 높은 검출
Mir-X™ miRNA 정량 시스템의 높은 특이성을 증명하기 위해, 8개의 매우 유사한 synthetic Let7 miRNA 변이체 (variants)를 이용하였다 (그림 2). 먼저 각각의 Let7 miRNA를 별도의 효모 polyA⁺ RNA 샘플에 섞어 주고, Mir-X™ single-tube 반응으로 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성한 각각의 cDNA와 variant-specific primers 패널을 이용하여 Let7 subtype을 정량하였다. 변이체와 primer 간에 매우 높은 유사성에도 불구하고(그림 2, Panel A), Mir-X™ qPCR system은 각각의 Let7 변이체를 검출하는데 매우 특이성 높은 결과를 보여주었다(그림 2, Panel B).


그림 2. Let7 miRNA 변이체 (variants)의 특이성 높은 검출
miRNA-specific primers (Panel A)를 이용하여, Mir-X™ qRT-PCR system으로 효모 polyA⁺ RNA 샘플에 각각 섞여 있는 8개의 synthetic Let7 변이체 (variants)를 특이적으로 검출 및 정량하였다. 이 primer 들은 각각의 해당 Let7 miRNA를 검출하였으며, 64개의 조합 중 63개에서 off target 변이체는 검출되지 않았다.

■ 다양한 응용 가능
Mir-X™ 시스템은 하나의 RNA 샘플에서 여러 개의 miRNA, shRNA 또는 mRNA를 검출할 수 있기 때문에 다양한 응용 분야에 적용할 수 있다. 원리상 polyadenylation이 되어 있거나, polyadenylation 할 수 있는 RNA라면 Mir-X™ 방법으로 정량 할 수 있다.

이 시스템을 이용하여, 마우스 배아 줄기 세포에서 trichostatin A (TSA) 처리에 반응하는 12개의 miRNA panel의 발현 변화를 모니터링 하였다 (그림 3).


그림 3. Trichostatin A 처리에 의한 마우스 ES 세포에서의 miRNA 발현양상 변화
마우스 배아 줄기 세포를 Trichostatin A (TSA)로 처리하기 전과 후 (18 시간)에 각각 harvest하였다. 세포에서 RNA를 추출한 다음, TSA에 의해 유도되는 것으로 알려진 12개의 miRNA와 p21 control mRNA에 특이적인 primer를 사용하여 Mir-X™ miRNA qRT-PCR로 분석하였다.

응집된 마우스 P19 세포 클러스터를 retinoic acid (RA)에 노출시키면, miRNA pool의 변화를 수반하는 신경 세포 표현형이 나타난다. Mir-X™ 시스템을 사용하여, RA에 의해 유도되고, RA에 5일 노출된 후 이들 세포에 계속 축적되는 miRNA 중 하나인 miR-9의 양을 추적하였다 (그림 4).


그림 4. Mouse P19 cells에서의 miR-9 유도
P19 mouse embryonic carcinoma cell을 agarose-coated petri dish에 plating 하여 retinoic acid (RA)를 추가 (+RA)하거나 넣지 않는 조건 (-RA)에서 embryoid bodies (EB)를 형성하였다. 배양 5일 후, EB를 trypsin으로 떼어내서 RA가 없는 조직 배양 dish에 re-plate하였다. 이 세포를 3-7일, 10-13일에 harvest 하였고, miR-9 정량은 Mir-X™ miRNA qRT-PCR TB Green Kit 와 miR-9 및 U6 (normalization control)에 특이적인 primer로 수행하였다.

■ Summary
Mir-X™ miRNA qRT-PCR TB Green kit은 실험에 필요한 모든 구성품이 포함된 complete kit이며, cDNA 합성과 qPCR이 가능한 dual-function system으로 하나의 RNA sample에서 분석하고자 하는 miRNA는 물론 다른 종의 RNA (shRNA, mRNA)의 발현 모니터링도 가능한 유연성 있는 시스템이다. Mir-X™ system의 single-tube cDNA 합성 과정은 빠르고 다른 방법보다 훨씬 덜 복잡하며, miRNA qPCR은 매우 민감하며 정확하다.