적용 제품	적용 논문
SMART-Seq® mRNA Kit	A pathogen-derived metabolite induces microglial activation via odorant receptors
	Nogo-B promotes angiogenesis and improves cardiac repair after myocardial infarction via activating Notch1 signaling

https://doi.org/10.1111/febs.15234
A pathogen-derived metabolite induces microglial activation via odorant receptors
NaHye Lee, YoonGyu Jae, Minhyung Kim, TaeHo Cho, ChaeEun Lee, Yu Ri Hong, Do Young Hyeon, Sanghyun
Ahn, Hongmok Kwon, Kyul Kim, Jae Hoon Jung, Sehyun Chae, Jeong-Oh Shin, Jinwoong Bok, Youngjoo
Byun, Daehee Hwang, JaeHyung Koo

아래 내용은 다카라코리아에서 직접 번역한 내용으로, 해석하는 과정에서 원작자의 의도와 상이한 내용이 포함되어 있을 수 있습니다. 학술 정보를 목적으로 하는 경우 원문을 참고하여 주시기를 바랍니다.


■ Abstract 미리보기
Microglia (MG, 미세 아교 세포)는 뇌의 신경 면역에 관여하는 주요 세포로써, 지속적으로 환경 변화를 감지하고 병원체, 독소 및 세포 debris에 반응하여 신경 염증에 영향을 미친다. 미생물 병원체는 신경 염증반응에 영향을 미치는 작은 대사 산물을 생산하지만, 이의 분자적 메커니즘이 신경 염증에서의 미세 아교 세포의 활성화에 어떤 영향을 미치는 지는 아직까지 밝혀지지 않았다. 본 논문의 저자들은 G protein-coupled recepto의 가장 큰 subfamily 인 odorant receptors (ORs)가 병원체에서 유래한 작은 대사 산물에 의해서 미세 아교 세포의 활성화에 관여한다고 가정하였다. MG 가 Streptococcus pneumoniae 가 분비하는 병인성 대사 산물인 2-pentylfuran을 인식하는 mouse OR 인 Olfr110 과 Olfr111을 높은 수준으로 발현한다는 것을 확인하였다. 이러한 상호작용은 MG를 활성화하여, chemotaxis, cytokine 생산, 식균 작용 (phagocytosis), 활성 산소 종 생성에 관여하며, 이는 Gαs-cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A-extracellular signal-regulated kinase 및 Gβγ-phospholipase CCa2+ pathway에 의해 매개되었다. 이를 종합했을 때, 본 논문에서는 병인성 유래 대사물질과 ORs 사이의 상호 작용을 확인하였으며, 병원체 인식에 의한 미세 아교 세포의 활성화에 대해 이해할 수 있었다.

■ Takara 제품을 이용한 method 미리보기
2 x 10⁶개의 primary MG 세포로부터 total RNA를 추출한 후, 8.5 이상의 RIN 값을 가지는 샘플을 이용해 mRNA sequencing에 활용하였다. Full-length cDNA는 SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing (Code 634888)을 이용해 제작하였다. First-strand cDNA 합성을 위해 1 ㎕ 3’ SMART CDS primer II A를 10 ng total RNA에 넣어, 72 °C에서 3분간 반응하였다. Second strand는 SMARTer-seq^® v4 oligo와 SMARTScribe reverse transcriptase를 넣어 합성하였고, 42 °C에서 90분간 반응한 후 70 °C에서 10 분간 반응하였다. Double-strand cDNA는 8 cycle의 PCR 과정을 통해 증폭되었으며, 정제 과정을 거쳐 Illumina^® 사의 Nextera XT DNA library preparation kit를 이용해 library를 얻었다. 제작된 library는 Illumina^® Hiseq 2500 기기에서 100 bp paired end의 dual index로 분석되었다.

■ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing (Code 634888)
ㄴSMART-Seq^® mRNA (Code 634772외)으로 리뉴얼 됨 (2022년 12월 21일)

• 범용적인 샘플 적용: 1,000개 이하 intact한 세포 혹은 10 pg - 10 ng의 high quality RNA (RIN > 8)
• Oligo dT priming을 통한 고품질의 full-length cDNA 합성
• 높은 재현성과 GC-rich transcript의 분석 coverage

SMART-Seq^® v4 PLUS Kit (Code R400752)
ㄴSMART-Seq^® mRNA LP (Code 634768외)으로 리뉴얼 됨 (2022년 12월 21일)

• Illumina^® library 제작을 위한 all-in-one kit
  - 구성: cDNA 합성 과정 + cDNA fragmentation + library prep kit + adapter / index
• ThruPLEX 기술을 접목하여, library 제작 과정이 single tube 내 3-step protocol로 매우 간편

https://doi.org/10.1038/s41419-022-04754-4
Nogo-B promotes angiogenesis and improves cardiac repair after myocardial infarction via activating Notch1 signaling
Yanjun Zheng, Jingrong Lin, Dingsheng Liu, Guoqing Wan, Xuefeng Gu & Jian Ma

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■ Abstract 미리보기
Nogo-B (Reticulon 4B)는 암의 발달 과정에서 신생 혈관 형성 (angiogenesis)의 조절자로써 알려져 왔다. 하지만, Nogo-B 가 혈관 형성과 심근 경색 후 (post-myocardial infarction, MI)의 심장을 회복하는 데 관여하는 지는 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 MI 과정에서 심장 회복 과정에서 Nogo-B의 역할과 기전을 탐구하고자 했다. 마우스 MI 모델의 심장과 심장으로부터 분리한 미세혈관 내피 세포 (cardiac microvascular endothelial cell, CMECs)에서 Nogo-B의 발현 수준이 증가된 것을 확인하였다. 또한, NogoB는 oxygen-glucose deprivation (OGD)에 노출된 CMEC에서 크게 upregulation 되었다. Nogo-B는 도입한 마우스 내피세포의 특이적 promoter 인 Tie2 와 함께 AAV9 로 도입되어 과발현 되었으며, 이는 심장 기능 개선, 흉터 크기의 감소, 신생 혈관 형성을 증가시켰다. RNA-seq 으로 분석했을 때, 경색의 경계 영역을 따라 분리된 CMEC에서 Nogo-B가 과발현을 보이면서 Notch 신호 전달 경로가 deregulated 되었음을 나타냈다. Nogo-B는 기계적으로 Notch1 신호 전달 경로를 활성화하고, 심근 경색에서의 Hes1을 upregulation 시켰다. 특정 siRNA 및 γ-secretase inhibitor 를 이용한 Notch 신호 전달 경로의 억제는 네트워크 형성 과정에서의 Nogo-B의 과발현과 분리된 CMEC의 이동 촉진 효과를 억제했다. 게다가, 내피 세포의 Notch1 heterozygous deletion 은 MI 모델에서 Nogo-B로 유도되는 cardioprotection 과 신생 혈관 형성을 억제했다. 이를 종합해볼 때, 본 연구는 Nogo-B가 Notch 신호 전달 경로를 활성화한 신생 혈관 형성의 조절 인자임을 증명하였고, 이는 Nogo-B가 허혈성 질환에 대한 새로운 분자적 타겟 물질임을 시사한다

■ Takara 제품을 이용한 method 미리보기
심근 경색을 유발한 1주일 후 AAV-NC와 AAV-Nogo-B를 감염시키고, CMEC로부터 total RNA를 추출하였 다. SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing (Code 634888)를 이용해 reverse transcription하여 합성된 cDNA는 제조사의 프로토콜에 따라 Advantage^® 2 Polymerase Mix (Code 639201)로 증폭되었다. 이후, KAPA Stranded mRNA Seq kit (KAPA)를 이용해 cDNA library를 제작한 후, Illumina^® HiSeq 2500 기기에서 150 bp paired end의 dual index로 분석되었다

■ 논문에서 사용된 Takara 관련 제품 알아보기
SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing (Code 634888)
ㄴSMART-Seq^® mRNA (Code 634772외)으로 리뉴얼 됨 (2022년 12월 21일)

• 범용적인 샘플 적용: 1,000개 이하 intact한 세포 혹은 10 pg - 10 ng의 high quality RNA (RIN > 8)
• Oligo dT priming을 통한 고품질의 full-length cDNA 합성

→ 다양한 분석 플랫폼을 위한 library 제작 시 활용 가능

Advantage^® 2 Polymerase Mix (Code 639201)

• 높은 감도와 증폭 효율을 가진 high yield PCR 효소
  : 3'→5' exonuclease activity를 가지며, T/A overhang 형태로 증폭 산물 형성
• 긴 길이의 template (최대 6 kb gDNA, 18.5 kb plasmid)에 적용 가능해, library 구축 시 적합