간섬유증 (liver fibrosis)은 그동안 치료가 불가능하다고 생각되어 왔다. 그러나 최근 Nature에서 발표한 연구에서 간섬유증 (liver fibrosis) 치료를 위한 새로운 mouse 모델을 개발했다 (Koda et al developed and characterized a new mouse model of liver fibrosis resolution). 이 연구에서는 새로운 mouse 모델과 single-cell RNA-seq (scRNA-seq), bulk mRNA-seq 두가지 RNA-seq 방법을 사용한 기능연구 결과 특정한 타입의 T-cell이 간섬유증 (liver fibrosis)의 주요 원인인 hepatic stellate cell을 apoptosis 시킨다는 점을 밝혔다.

■ Inflammation from NAFLD and NASH leads to liver fibrosis
Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)는 전세계에서 다양한 만성 간 질환의 주 원인으로 알려져 있다. NAFLD는 지방증 (steatosis)이라 부르는 간세포 (hepatocyte)에서의 과도한 지방 축적이 특징이다. 또한 지방증 (steatosis)은 간의 돌출부에 염증이 발생하면 non-alcoholic steatohepatitis (NASH)로 별도로 분류되기도 한다. 이런 NAFLD와 NASH 환자들의 일부는 간섬유증 (liver fibrosis)를 겪고 있고 간경화증 (cirrhosis) 또는 간암 (liver carcinoma)까지 악화되기도 한다.

분자생물학의 수준에서 NAFLD와 NASH에 의해 hepatocyte가 지속적으로 사멸하면 침윤 면역세포 (infiltrating immune cell)에 의해 다양한 chemokine 과 cytokine이 방출되고 이로 인해 염증 반응이 유발된다. 이러한 chemokine 과 cytokine이 간섬유증 (liver fibrosis)의 주요 원인인 hepatic stellate cell을 활성화시킨다 (activation of hepatic stellate cells, which once activated, are the main drivers of liver fibrosis.).

■ A new mouse model for liver fibrosis resolution: the RES model
간섬유증 (liver fibrosis)의 치료 매커니즘을 연구하기 위해 우선 간섬유증 (liver fibrosis)이 치료되는 것을 관찰할 수 있는 모델이 필요했다. 이를 위해 먼저 기존의 mouse 모델에 지속적으로 고지방, 고콜레스테롤 먹이를 주어 NASH를 유발하고 24주 뒤 정상 식단으로 다시 전환하였다 (RES 모델로 명시). 이 mouse model은 고지방, 고콜레스테롤 식단 (HFHC diet) 동안 확연한 간섬유증 (liver fibrosis)을 보였고, 정상 식단으로 전환한지 8주 후에 본래의 상태로 회복되었다.


그림 1. 정상 식단 (ND) / 고지방, 고콜레스테롤 식단 (HFHC)/ 고지방, 고콜레스테롤 식단에서 정상 식단으로 전환한 지 8주 뒤 Mouse 모델 (RES)
Image adapted from Koda et al. 2021, Nat. Commun. under a CC BY 4.0 license.

■ Uncovering a mechanism for reversal of liver fibrosis using both single-cell and bulk mRNA-seq
연구 결과, 정상 식단 (ND) 모델보다 RES 모델의 mouse에서 CD8+ T cell이 더 높게 유지되었다. 따라서 이러한 세포수가 간섬유증 (liver fibrosis)의 치료에서 주요한 역할을 할 것이라고 가정하고 이후 실험을 진행했다. 이를 증명하기 위해 연구자들은 scRNA-seq을 사용해 ND (정상 식단) / HFHC (고지방, 고콜레스테롤 식단) / RES (고콜레스테롤 식단에서 정상 식단으로 전환한 지 8주 뒤)의 세가지 Mouse 모델의 CD8+ T cell을 17개의 cluster로 분류했다. 그리고 이 17개의 cluster 들을 다시 4개의 CD8+ T cell 하위 그룹으로 분류했다. 그 결과 RES mouse 모델에서 특정 하위 그룹의 CD8+ T cell (the resident memory T cells (trm cells))의 양이 증가된 것을 확인했다.


그림 2. 정상 식단 (ND) / 고지방, 고콜레스테롤 식단 (HFHC)/ 고지방, 고콜레스테롤 식단에서 정상 식단으로 전환한 지 8주 뒤 Mouse 모델 (RES)의 간에서 분리된 CD8+ T cell의 UMAP projection (Trm 하위 그룹에 속하는 cluster의 부분이 표지 되어있다.)
Image adapted Koda et al. 2021, Nat. Commun. under a CC BY 4.0 license.

이후 Trm cell이 간섬유증 (Liver fibrosis)의 치료에 어떻게 기여할 수 있는지를 더욱 확인하기 위해 연구자들은 bulk full-length RNA-seq인 SMART-seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing (해당 제품은 현재 SMART-Seq^® mRNA로 제품명이 변경됨)을 사용했다. 이러한 접근법을 사용하면 RES 모델, HFHC 모델, ND 모델에서 CD8+ T cell 하위 그룹에서 transcriptome 차이점을 비교하는 것이 가능하다. 또한 bulk RNA-seq 데이터는 scRNA-seq 데이터의 결과를 보강하는 것 뿐만 아니라 RES 모델과 HFHC 모델의 trm cell에서 세포독성과 주화성의 관련인자 (cytotoxic and chemotactic mediators)의 발현이 증가하는 것을 추가로 발견했다. 특히 이중 매우 강하게 발현되는 Ccl5에서 발현되는 단백질의 receptor가 fibrosis 치료 중에는 hepatic stellate cell에서 발현되는 반면, fibrosis가 진행중에는 발현 되지 않는다는 점을 발견했다. Transcriptome 분석 결과를 바탕으로 연구자들은 functional study를 통해 trm 세포가 CCR5에 의존적으로 hepatic stellate cell에서 세포사멸을 유도하여 간섬유증 (liver fibrosis)를 치료한다는 점을 보여주었다.

위의 Koda와 그 동료들의 연구 사례에서 볼 수 있듯, single cell과 bulk RNA sequencing 중 하나의 접근법만 선택하는 것 보다 두가지를 모두 진행하는 것으로 연구에서 집중해야 할 cell type을 스크리닝 할 뿐 아니라 transcriptome에 대한 보다 심도있는 분석이 가능하다. 이러한 데이터에 기초한 functional study는 잠재적으로 NAFLD, NASH및 간섬유증 (liver fibrosis)의 치료를 위한 생물학적 매커니즘의 발견을 이끌었다.

■ Reference
Koda, Y. et al. CD8+ tissue-resident memory T cells promote liver fibrosis resolution by inducing apoptosis of hepatic stellate cells. Nat Commun 12, 4474 (2021).

Tsuchida, T., Friedman, S. Mechanisms of hepatic stellate cell activation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 14, 397-411 (2017).

■ 원문
https://www.takarabio.com/about/bioview-blog/single-cell-analysis/two-rna-seq-approaches-reveal-resident-memory-t-cells-hold-the-power-to-reverse-liver-fibrosis