Takara는 인디애나대학교와 협업하여 recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin^® reagent)를 개발했다. RetroNectin^®은 hematopoietic stem cell에서 retrovirus의 transduction 효율을 극적으로 향상시켰고, 이 획기적인 발견은 기존에 hematopoietic stem cell은 유전자를 transduction하는 것이 불가능하다는 생각을 뒤엎었다.

Reference
Hanenberg, H., et al., Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells. Nat. Med. 2(8):876-882 (1996).

Q1. RetroNectin^®이란 무엇인가요?
RetroNectin^®은 세개의 domain (cell-binding domain, heparinbinding domain, CS-1 sequence)으로 구성된 recombinant human fibronectin fragment (rFN-CH-296; 574 amino acids; ~63 kD)입니다. RetroNectins^®은 타겟 세포와 lenti- 혹은 Retrovirus의 물리적 거리를 좁혀 transduction 효율을 높입니다.
기존 RetroNectin^® (Code T100A)과 동일한 프로토콜을 사용하고 성능은 그대로지만, 생산 공정의 업그레이드로 더 저렴하게 사용할 수 있는 신제품 RetroNectin^® Pro (Code T101A/B) 버전도 있습니다.

Q2. Fibronectin이란 무엇인가요?
Fibronectin이란 높은 분자량 (220-250 kD)을 가진 세포외 기질의 구성 요소 중 하나입니다. Dimer 형태로 존재하며, 세포의 이동 (cell migration), 형태 (morphology), 생장 (growth)과 부착 (adhesion)에 관여합니다.

Q3. RetroNectin^®은 어떻게 transduction enhancer로 작용하나요?
RetroNectin^®은 retrovirus (혹은 lentivirus)와 타겟 세포의 물리적 거리를 좁혀 바이러스의 transduction을 촉진합니다. 이때 virus particle이 RetroNectin^®의 heparin domain에 결합하고 타겟 세포에 있는 cellular integrin (VLA-4 또는 VLA-5)이 RetroNectin^®과 상호작용해 transduction이 촉진되는 것으로 생각되고 있습니다.



Q4.VLA-4 (Very Late Antigen-4)와 VLA-5 (Very Late Antigen-5)는 무엇인가요?
VLA-4와 VLA-5는 integrin superfamily에 속해 있으며, integrin α4β1과 integrin α5β1으로도 알려져 있습니다. 이러한 integrin은 세포 표면에 있는 receptor로 세포-세포 및 세포- 세포외기질 (extracellular matrix)의 상호작용에 관여한다.

Q5. RetroNectin^®은 어떤 cell에 적용할 수 있나요?
RetroNectin^®은 integrin VLA-4 또는 VLA-5를 발현하는 세포에 매우 효과적입니다. 세포에 있는 integrin 분자들은 RetroNectin^®의 CS1 site 및 cell-binding domain과 상호작용합니다. 일반적으로 VLA-4는 T-cell, B-cell, monocyte, NK cell, eosinophil, bone marrow monocytic cell, lymphoid progenitor 등에서 발현되고, VLA-5는 thymocyte, activated T-cell, mast cell 등에서 발현됩니다.

Q6. RetroNectin^®은 어떤 바이러스와 사용할 수 있나요?
RetroNectin^®은 lentivirus와 retrovirus의 transduction에 사용할 수 있습니다. 이 외 핵산 도입에 적용이 가능한 지는 확인되지 않았습니다.

Q7. RetroNectin^®은 다양한 envelopes에 사용 가능하나요?
RetroNectin^®은 ecotropic과 amphotropic에 모두 효과적이며, GALV 형태의 envelope에도 사용 가능합니다. VSV-G (Vesicular stomatitis virus G) pseudo형태의 Lentivirus/Retrovirus도 세포내 도입효율을 높일 수 있습니다.

Q8. RetroNectin^®을 사용하면 transduction 효율을 얼마나 증가시킬 수 있나요?
Viral supernatant infection method (세포와 바이러스를 섞은 후 RetroNectin^®에 적용)를 사용한 경우, RetroNectin^®은 human CD34+ cell에서 50~70%, mouse bone marrow mononuclear cell에서 20~30%까지 transduction 효율을 증가시켰습니다.

Q9. RetroNectin^®을 이용할 때 일반적으로 어느 정도의 세포독성이 관찰되나요?
Polybrene에 비해 RetroNectin^®은 독성이 매우 낮은 것으로 확인되었습니다. 예시로 0.25 mg/㎖의 RetroNectin^®이 첨가된 배지에서 NIH3T3 cells을 배양한 결과, 세포의 성장에는 거의 영향이 없다는 점이 확인되었습니다.

Q10. RetroNectin^®을 polybrene과 함께 사용할 수 있나요?
동시에 사용하는 것은 권장되지 않습니다. RetroNectin^®과 polybrene을 함께 사용하면 오히려 유전자 도입효율이 감소합니다.

Q11. RetroNectin^®의 코팅을 위해서는 어떤 형태의 plate를 사용해야 하나요?
코팅이 되지 않은 배양 plate나 dish를 사용해야 합니다. Takara에서 코팅 plate (예: collagen 코팅 plate)와 코팅이 되지 않은 plate를 사용하여 실험한 결과, 코팅 plate에서 효율이 1/5로 감소하는 것을 확인하였습니다. 따라서 6-well BD-Falcon (#351146) plate 등의 사용을 권장합니다.

Q12. 코팅된 배양 plate를 사용하였을 때 효율은 어떠한가요?
실험 결과, 코팅이 되지 않은 plate에 RetroNectin^®을 코팅한 후 transduction 효율 측정결과 30% 이상을 보였지만, 코팅이 되어있는 plate에 RetroNectin^®을 코팅하여 측정한 결과 1~3% 정도의 효율이 보였습니다.

만약 double 코팅된 plate가 필요할 경우, 아래 두 가지 방법을 모두 테스트 해보시기 바랍니다.
(1) RetroNectin^®을 먼저 코팅한 후 collagen (또는 다른 물질) 코팅
(2) Collagen (또는 다른 물질)을 먼저 코팅한 후, RetroNectin^® 코팅

위의 두 가지 방법의 도입 효율이 좋지 않다면, 아래의 방법으로 진행해 주시기 바랍니다.

코팅하지 않은 일반 plate에 RetroNectin^®을 코팅하여 transduction 후 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양.
이후 transduction 된 세포를 모아서 collagen (또는 다른 물질)에 코팅된 plate에서 다시 2~3일간 배양.

Q13. RetroNectin^®은 몇회의 동결/융해가 가능한가요?
RetroNectin^®은 최대 5번의 동결/융해가 가능합니다. 이 이상의 동결/융해는 피하고, 오염에 노출되지 않도록 주의 바랍니다.

RetroNectin^® GMP grade (Code T202)는 융해 후 다시 동결이 불가능합니다.
RetroNectin^® (Code T100A/B)은 -20℃에서 1년, 4℃에서 약 3주간 안정합니다.
RetroNectin^® Pro (Code T101A/B) 는 -20℃에서 보관하며, 동결/융해는 최대 10회까지 가능합니다.

Q14. RetroNectin^®이 코팅된 plate (pre-coated RetroNectin plate)는 얼마나 오래 안정한가요?
RetroNectin^®이 코팅된 plate는 4℃에서 약 1~2개월 보관 가능하나, 가능하면 빨리 사용하는 것을 권장합니다 (-20℃에는 보관하지 마세요.).

Q15. RetroNectin^®은 사용 전 filter 멸균 과정이 필요 한가요? 만약 필요하다면, 어떤 타입의 Filter를 사용해야 하나요?
RetroNectin^®은 멸균된 solution 상태로 제공됩니다. 따라서, 별도의 Filter과정은 필요하지 않습니다.

Q16. Clinical-grade (GMP) RetroNectin도 판매하나요?
네, GMP 가이드라인에 따라 높은 퀄리티로 생산된 RetroNectin^® GMP grade (Code T202)을 판매하고 있습니다. 연구용 제품으로, ex vivo clinical application에 적용 가능합니다 (연구 목적으로 제한되어 있습니다.).

Q17. RetroNectin^®을 X-fold bag과 같은 cell culture bag에 coating 할 수 있나요?
네, X-Fold bag은 RetroNectin^®으로 코팅할 수 있습니다. 아래의 적용 예를 참고 바랍니다.

X-Fold bag (85 ㎝²)
    1) RetroNectin^®*을 4℃에서 overnight 또는 상온에서 2시간 동안 코팅한다.
    *최소한 bag 당 9 ㎖의 RetroNectin^® (20 μg/㎖)을 사용한다.
    2) PBS로 wash 한다 (30 ㎖ x 3번).
    3) Lentivirus/Retrovirus를 첨가한다 (4~6시간 동안).
    4) PBS로 wash 한다 (30 ㎖).
    5) 세포를 첨가한다. (1 x 104 cells/㎝²).
    6) 37℃, 5% CO₂에서 3일간 배양한다.
    주의 : 이 방법은 다른 형태, 다른 브랜드의 cell culture bag과 호환되지 않을 수 있습니다.
    Takara에서는 CultiLife™ 215 Culture bag (Code FU0005)를 같이 사용하는 것을 추천합니다.

Q18. RetroNectin^®의 transduction 효율을 증가시키는 방법이 있을까요?
아래 방법으로 RetroNectin^®을 사용하여 도입 효율을 증가시킬 수 있습니다.
1) 고역가의(106 cfu/㎖ 이상) Lentivirus/Retrovirus를 사용하고, 60~70%의 도입 효율에 얻기 위해서는 Lentivirus/Retrovirus solution (≥ 1.15x 106)을 10배 이상 농축시켜 사용하는 것을 추천한다.
2) 바이러스를 RetroNectin^®이 코팅된 plate에 200-250 ㎕/㎝2으로 첨가하고, 4~5시간 동안 32℃에서 배양한다..
3) 바이러스를 로딩한 plate가 마르지 않도록 조심하면서, 부유물을 제거하고, PBS로 wash합니다. PBS wash 후, Target cell을 즉시 growth media와 함께 넣는다. 만약 plate가 마르게 되면 도입 효율이 크게 감소할 수 있다.

Q19. RetroNectin^®으로 transduction 후 코팅된 plate에서 세포를 분리 (dissociation) 할 때 추천되는 방법이 있나요?
HL60이나 K562 세포의 경우 파이펫팅으로 쉽게 회수가 가능합니다. 그러나 일부 다른 세포들은 별도로 trypsin 처리가 필요한 경우도 있습니다. Trypsin을 사용하는 방법은 세포에 damage를 줄 수 있기 때문에 파이펫팅으로 회수가 불가능한 세포에만 사용하는 것을 권장합니다.

약하게 부착되어 있는 (또는 부유 상태) 세포는 0.02% EDTA/PBS solution을 사용하여 세포를 분리시킵니다.
1) Transfection 이후, plate의 상층액을 centrifuge tube에 모은다.
2) PBS로 plate를 wash하여 부유 세포를 모은다.
3) 부착되어 있는 세포를 사용자 매뉴얼에 따라 Cell Dissociation Buffer (GIBCO; enzyme free, PBS-based)로 분리한다.
4) 획득한 세포를 하나의 centrifuge tube에 모으고, centrifuge하여 세포를 침전시킨다.
5) Centrifugation 후 HBSS/Hepes를 사용하여 세포를 두 번 wash하고, HBSS/Hepes에 있는 부유 세포는 다음 단계실험에 사용한다.

Fibroblast와 같이 EDTA/PBS solution으로 세포가 분리되지 않는 세포는 trypsin-EDTA (without Ca2+ and Mg2+)를 사용 가능합니다.

Q20. RetroNectin^®이 코팅된 plate로부터 Trypsin 또는 Cell Dissociation Buffer를 사용하여 세포를 분리한 후, 같은 plate에 세포가 다시 부착되나요? 만약 96 well plate에서 FACS를 한다면, 세포를 새로운 plate로 옮겨야 하나요?
Trypsin 또는 Cell dissociation buffer를 사용하여 분리시킨 세포는 같은 plate에 다시 부착할 수 있습니다. FACS 실험을 위해서는 multi-channel pipette으로 다른 plate로 바로 옮길 것을 권장합니다.