■ Introduction
Adeno-associated virus (AAV)는 in vivo로 세포에 유전자를 전달하는 데에 많이 사용되는 수단이다. AAV는 낮은 병원성, 바이러스의 지속성, 광범위한 세포 감염성 등의 특징을 가지고 있어 질병 모델을 만들거나 유전자 기능을 연구하는데 효과적이다.

In vivo transduction을 위한 AAV를 준비할 때, 높은 순도와 역가가 transduction 효율에 매우 중요하다. 미정제 용해물 (crude lysate)은 타겟 조직이나 세포에 독성을 나타낼 수 있기 때문에 in vivo로 사용할 때 이러한 바이러스의 정제는 필수적이다. 또한 실험의 재현성을 위해서는 바이러스 역가를 정확하게 측정해야 한다. 아래 예시에서는 높은 역가의 transduction-ready 재조합 AAV를 생산하기 위한 시스템인 AAVpro^® 시리즈를 사용하여 뇌세포에 in vivo transduction을 하기 위한 AAV2를 생산하였다. 생산된 AAV2는 in vivo로 쥐의 특정 뇌 영역 세포에 밝은 형광 마커를 성공적으로 전달함을 확인하였다.

AAVpro^® workflow에 대하여 더 알아보기 ≫

■ Results
선조체 (striatum) 전체에서 강한 녹색 형광이 관찰되었다 (왼쪽 패널). 또한, 담창구 (globus pallidus)의 뉴런에서 ZsGreen1 발현이 관찰되었다 (오른쪽 패널).

그림 1. 뇌의 관상단면에서의 ZsGreen1 발현.
왼쪽 패널은 뇌 단면의 전체를 보여주며 (scale bar, 1 ㎜); 선조체에서의 강한 형광을 볼 수 있다. 오른쪽 패널은 왼쪽 패널의 일부를 확대한 것 (scale bar, 30 ㎛)으로 담창구에서의 ZsGreen1 발현을 보여준다. Data credit: Prof. Muramatsu Shinichi (Jichi Medical School).

■ Conclusions
AAV의 순도와 역가는 각 동물 개체에게 높은 transduction 효율을 나타내는데 매우 중요하다. AAVpro^® 시스템으로 제작한 AAV2는 in vivo로 쥐의 뇌에 transduction하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
AAVpro^® 제품에 대하여 더 알아보기 ≫

■ Methods
AAV2는 AAVpro^® Helper Free System (AAV2) (Code 6230) 와 pAAV-ZsGreen1 Vector (Code 6231)를 사용하여 권장 프로토콜을 따라 제작하었다. Helper Free System은 고역가 AAV를 위해 helper virus를 사용하지 않는 독자적인 method를 제공하며, HEK293T에 transfection되어 AAV 제작에 필요한 단백질을 발현하는 플라스미드를 포함하고 있다. 마지막으로 pAAV-ZsGreen1은 밝은 녹색 형광 단백질을 표적 세포로 전달할 수 있는 AAV 벡터다.

AAV2-ZsGreen1 제작을 위한 293T 세포는 transfection 하루 전에 배양하여 사용하였다. AAVpro^® Helper Free System (AAV2) (Code 6230)의 pRC2-mi342 및 pHelper 플라스미드와 pAAV-ZsGreen1은 매뉴얼에 기술된 Calcium phosphate transfection 방법으로 사용해 transfection 하였다. 이후 48시간 뒤, 0.5 M EDTA (pH 8.0)를 사용해 세포를 분리하였다.

AAV2는 AAVpro^® Purification Kit (AAV2) (Code 6232)를 사용하여 초원심분리를 이용하지 않고 간단하고 빠르게 정제하였다. 간단하게 packaging cell을 원심분리로 회수하고 AAV Extraction Solution을 사용해 바이러스를 추출하였다. 추출된 용액은 Cryonase Cold-active Nuclease 를 처리하고 미리 준비된 정제 컬럼에 넣어 컬럼에서 washing 이후 용출하였다. 이후 용출된 용액에서 고순도로 정제된 AAV2-ZsGreen1 바이러스를 얻기 위해 탈염 및 농축 과정을 거쳤다. 정제 이후에는 AAVpro^® Titration Kit (for Real Time PCR) (Code 6233) 으로 AAV2-ZsGreen1 바이러스의 역가를 측정하였으며, 2.4 × 10¹² vector genomes (vg)의 정제된 AAV2-ZsGreen1를 얻어냈다.

정제된 AAV2-ZsGreen1은 PBS에 1.86 × 10¹² vg/㎖로 희석하여, 쥐 선조체의 왼쪽과 오른쪽 각 지점에 stereotactic surgical technique으로 5 ㎕씩 주입하였다. 27일 후, 마취된 쥐에 고정액 (4% paraformaldehyde가 포함된 용액)을 관류하여 뇌를 적출하고 동결하여 만든 얇은 관상단면을 형광현미경으로 이미지화 하였다.