- Helper virus를 사용하지 않고 안전하게 adeno-associated virus vector (AAV vector) 제작
- 독자적인 AAV Extraction Solution을 이용한 효율적이고 간편한 AAV vector 추출
- AAV2 system은 hsa-miR-342 탑재한 vector 사용으로 고역가 바이러스 제작
※ 본 제품은 Cloning을 위해 In-Fusion
® 시약을 함께 사용할 수 있으며, 원활한 결과를 얻기 위해
제품 사용 전 In-Fusion® 원리(동영상링크)를 반드시 참고해주시기 바랍니다.
제품 설명
Adeno-Associated Virus(AAV)는 분열하거나 분열하지 않는 세포 모두에 감염시킬 수 있는 non-enveloped의 single stranded DNA virus이다.
AAV는 helper virus가 존재시에만 복제가 가능하며 인간에게는 비병원성이다. 이런 특징으로 다양한 세포에 유전자를 도입하는 유용한 방법이며
유전자치료를 위한 유용한 vector로 사용되고 있다.
AAV는 다양한 혈청형이 존재하고 혈청형에 따라 host나 바이러스의 특징이 다른 것으로 알려져 있다. Serotype 2 (AAV2)는 오래전부터 널리
연구되어 온 serotype으로 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. Serotype 1 (AAV1), Serotype 5 (AAV5), Serotype 6 (AAV6)는 보다 조직 감염특이성을
가진 혈청형으로, AAV1은 근육, 간, 기도, 중추신경계 등에, AAV5 는 중추신경계, 간, 망막 등에, AAV6는 심장, 근육, 간 등에 대한 유전자 도입효율이
높다고 알려져 있다.
다카라에서는 Serotype 1, 2, 5, 6의 AAV vector를 helper virus없이 안전하게 제작하기 위한 AAVpro Helper Free System을 판매하고 있다.
본 제품으로 만들어진 AAV 바이러스 입자를 이용하여 표적 세포나 동물 개체에서 목적 유전자를 일시적으로 발현시킬 수 있다.
AAVpro® Helper Free System으로 AAV Particle 제작
AAVpro® Helper Free System은 helper virus를 사용하지 않고, 고역가의 AAV를 제작하는 시스템이다. 본 제품에 포함된 3종류의 플라스미드를 HEK293T
세포에 도입하여 간편하게 AAV입자를 제작할 수 있다.
- pAAV-CMV: CMV promoter와 목적유전자를 삽입하기 위한 MCS 및 2개의 ITR을 포함하는 vector plasmid
- pRC Vector: AAV2의 Rep 유전자와 각 serotype의 Cap 유전자를 포함한 packaging plasmid
- pHelper: AAV를 생산하기 위해 필요한 adenovirus E2A, E4와 VA 유전자를 포함하는 packaging plasmid
기존에 동결/융해법 또는 초음파 파쇄법이 아닌 다카라에서 독자적으로 개발한 AAVpro® Extraction Solution을 이용하면 AAV producing cell로부터 숙주단백질이나
핵산의 혼입을 최소화하며, 간편하게 AAV vector입자를 추출할 수 있다. 추출시약은 System 제품내에 포함되어 있으며, AAVpro® Extraction Solution
(Code 6235)으로도 판매하고 있다.
또한 고효율의 in vivo 유전자 도입을 위한 AAV 정제에는 AAVpro® Purification Kit (All Serotype) (Code 6666) 또는 AAVpro® Purification Kit
(AAV2)(Code 6232)를 이용할 수 있다.
그림 1. AAVpro® Helper Free System을 사용한 AAV 생산.
HEK293T cells에 세 종류의 plasmid (pHelper, pAAV-CMV, pRC2-mi342)를 co-transfection하면 recombinant AAV를 생산하는데 필요한 모든 단백질을 발현하게 된다. 이후 cell 안에서 packaging된 AAV는 AAVpro® Extraction Solution (Code 6235)를 통해 추출할 수 있다.
그림 2. miRNA-342를 사용한 AAV2 system에서의 고역가 AAV 생산.
AAVpro® Helper Free System (AAV2)에 포함된 세 종류의 plasmid를 HEK293 cell에 co-transfection 하고, serotype 2의 AAV를 hsa-miR-342를 발현하는 cell (pRC2-mi342)과 발현하지 않는 cell (pRC2) 두 종류의 packaging cell에서 추출하였다. 이후 AAV의 titer를 qPCR을 사용해 측정한 결과 (e.g. AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) (Code 6233)) hsa-miR-342를 발현하는 경우, 발현하지 않는 경우 보다 2배 높은 역가의 AAV를 생산할 수 있었다.
그림 3. 각 system에 포함된 3종류의 plasmid map
(pRC2-mi342 vector는 Code 6230 제품에 포함된 vector입니다. 그외 다른 system에 포함된 vector는 상기 제품매뉴얼을 참고하세요.)
내용
AAVpro® Helper Free System (AAV2) (Code 6230)
| 1 |
pAAV-CMV Vector (1 ㎍/㎕) *1 |
20 ㎕ |
2 |
pRC2-mi342 Vector (1 ㎍/㎕) *2 |
20 ㎕ |
3 |
pHelper Vector (1 ㎍/㎕) |
20 ㎕ |
4 |
AAV Extraction Solution A |
1.5 ㎖ × 3 |
5 |
AAV Extraction Solution B |
150 ㎕ × 3 |
*1 pAAV-CMV Vector에 삽입할 목적유전자의 사이즈는 ~2.5 kb 이다.
*2 AAVpro® Helper Free System (AAV1) (Code 6673)에는 pRC1 vector, AAVpro® Helper Free System (AAV5) (Code 6650)에는 pRC5 Vector, AAVpro® Helper Free System (AAV6)(Code 6651)에는 pRC6 Vector이 포함되어 있다.
AAVpro® Packaging Plasmid (AAV2) (Code 6234)
| 1. |
pRC2-mi342 Vector (1 ㎍/㎕) *3 |
0.5 ㎖ × 2 |
2. |
pHelper Vector (1 ㎍/㎕) |
0.5 ㎖ × 2 |
*3 AAVpro® Packaging Plasmid (AAV1) (Code 6672)에는 pRC1 vector, AAVpro® Packaging Plasmid (AAV5) (Code 6664)에는 pRC5 Vector, AAVpro® Packaging Plasmid (AAV6)(Code 6665)에는 pRC6 Vector이 포함되어 있다.
보존 -20 ℃
단, AAV Extraction Solution A및 AAV Extraction Solution B는 융해 후, 실온 저장
관련제품
