PrimeSTAR LongSeq DNA Polymerase (Code R055A)

• 다카라의 독자 기술로 long fragment (50 kb 이상) 증폭 실현
• GC/AT rich 서열의 long fragment도 증폭 가능
• 높은 특이성: 비특이적인 증폭을 억제하고 long fragment의 multiplex PCR 적용 가능
• 반복서열에 대한 탁월한 증폭
• Long-read NGS를 위한 균일한 coverage 생성 가능

■ Introduction
3세대 시퀀싱이라 불리는 Long-read NGS는 일반적으로 20kb 이상의 read를 생성하나, 이와 대조적으로 기존 NGS 시퀀싱 기술은 일반적으로 150~300 bp의 read를 생성한다. 일반적으로 짧은 read는 유전체 내의 반복서열, 구조적 변이, 긴 polymer 구역을 정확하게 식별하기에 한계가 있다. 반면 Long-read NGS는 이러한 반복서열에 대한 정확한 read를 제공할 수 있지만, 길고 복잡한 구조의 DNA를 PCR 증폭하는 것이 종종 어려운 경우가 있어 Long-read NGS의 활용에 한계가 있고, 길고 반복적인 GC/AT 서열의 DNA를 특이적으로 증폭해야 하는 연구에는 적합하지 않다.
이러한 문제를 해결하기 위해 다카라바이오는 길이가 길고 GC/AT rich한 서열 (최대 80% GC)의 특이성 높은 증폭을 위해 최적화된 DNA polymerase를 개발하여 테스트를 실시하였다.

■ Result
최대 53kb의 초장거리 PCR 증폭
PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase (이하 PrimeSTAR^® LongSeq) 를 이용하여 0.5 kb~ 53 kb 사이즈의 human genomic DNA (gDNA)를 성공적으로 증폭하였다.



그림1. 0.5~53 kb까지 다양한 길이의 타겟을 비특이적인 증폭 없이 성공적으로 증폭한 PrimeSTAR^® LongSeq
Lane M1: 1 kb DNA ladder. Lane 0.5 kb: p53 target. Lane 1 kb: DCLRE1A target #1. Lane 2 kb: DCLRE1A target #2. Lane 4 kb: DCLRE1A target #3. Lane 15 kb: β-globin target #1. Lane 24 kb: β-globin target #2. Lane 30 kb: β-globin target #3. Lane 40 kb: HBB target. Lane 53 kb: SLC30A9 target.

타사의 다섯 가지 long-range PCR 효소와 비교한 결과, PrimeSTAR^® LongSeq 는 52~53 kb 타겟 증폭이 더 우수했으며 다양한 타겟에서 높은 증폭효율과 낮은 비특이적인 증폭을 보였다 (그림 2).



그림 2. 매우 다양한 사이즈의 타겟 증폭에서 압도적인 증폭 효율을 나타내는 PrimeSTAR^® LongSeq
Human gDNA에서 52~53 kb 타겟을 증폭하기 위해 PCR을 수행하였고, PCR 산물은 magnetic beads로 정제하여 100 pg을 Femto Pulse system (Agilent Technologies)로 분석하였다.
Lane M: Agilent 165 kb DNA Ladder. Lane 1: PUM1 target (52 kb). Lane 2: SLC30A9 target (53 kb).

GC/AT rich 서열의 증폭
GC rich 서열은 hairpin과 같은 2차 구조를 형성하기 쉽고 melting 온도가 더 높으며, AT-rich 서열은 DNA 이중구조를 불안정하게 만들고 annealing 온도가 더 낮다. 이러한 특성은 종종 PCR 반응 조건 최적화를 필요로 하며 multiplex PCR 시 GC/AT rich 서열로 인해 조건 설정에 어려움을 야기할 수 있다.
기본 반응 조건에서 PrimeSTAR^® LongSeq는 GC 65~66%의 17~20 kb 서열을, AT 65~66%의 16~21 kb 서열을 성공적으로 증폭시켰고 (그림 3), GC/AT rich 서열을 서열로으로 한 multiplex PCR에서도 깨끗한 증폭 결과를 확인하였다 (그림 4).



그림 3. 성공적인 GC/AT rich 서열 증폭.
비특이적인 증폭이 빈번한 GC/AT rich 서열도 PrimeSTAR^® LongSeq을 사용하면 특별한 buffer나 별도의 반응 조건 최적화 없이 long-range PCR이 가능하다.



그림 4. GC/AT rich 서열의 multiplex PCR에서도 안정적인 증폭이 가능한 ^® LongSeq
두 세트의 프라이머로 GC/AT rich 서열을 동시에 증폭하였고, 프라이머는 최종 농도 0.2 μM으로 사용하였다. 증폭 후 4200 TapeStation System (Agilent Technologies)으로 증폭을 확인하였다. Lane 1: 7 kb target (GC: 68%) 및 21 kb target (AT: 65%), Lane 2: 7 kb target (GC: 68%), Lane 3: 21 kb target (AT: 65%), Lane M: ladder, Lane 4: 8 kb target (AT: 66%) 및 20 kb target (GC: 65%), Lane 5: 20 kb target (GC: 65%), Lane 6: 8 kb target (AT: 66%)

온도 안정성 (Temperature stability)
모든 mixture를 첨가한 후 PCR cycle을 시작하기 전까지 4 ℃ 또는 실온에서 PCR 반응액의 안정성을 유지하는 것은 일상적인 실험 지연 상황이나 high throughput 실험에 적용하기 위한 필수 조건이다. 이러한 온도 안정성은 특히 자동 분주 장치 (automated liquid handler)를 사용하여 PCR 반응을 셋팅하는 경우에 매우 중요하다.
PrimeSTAR^® LongSeq은 PCR 반응액을 준비한 후 4 ℃에서 17시간 또는 실온에서 1시간 보관 후 반응에 사용해도 높은 특이성을 유지할 수 있었다 (그림 5).



그림 5. 다양한 조건에서도 높은 특이성을 유지하는 PrimeSTAR^® LongSeq
4℃에서 17시간 또는 실온에서 1시간 동안 PCR mixture를 보관한 경우에도 비특이적인 증폭을 억제하기 때문에 자동화된 workflow에 적합하다.

반복서열의 20-plex PCR을 통한 long-read NGS 분석
반복되는 DNA 서열을 PCR 증폭하는 것은 종종 실험 상의 문제를 야기한다. 반복 서열은 hairpin 구조를 형성하기 쉬운데, 이는 DNA polymerase의 해리를 촉진하여 이로 인해 합성된 불완전한 단편이 mega primer로서 기존 primer의 역할을 대체하게 된다.
PrimeSTAR^® LongSeq으로 PacBio PureTarget 패널의 repeat expansion loci 20개를 테스트 하였고 (표 1), 이러한 human loci는 헌팅턴병 및 근긴장성 이영양증을 포함한 반복 확장 질환 (repeat expansion disorders) (Ibanez et al. 2024)와 관련이 있다.

표 1. 실험에 사용된 repeat expansion 패널

Label	Chromosome	Target	Repeat Definition
A	chr12	ATN1	MOTIFS = CAG; STRUC = (CAG)n
B	chrX	AR	MOTIFS = GCA; STRUC = (GCA)n
C	chr6	ATXN1	MOTIFS = TGC; STRUC = (TGC)n
D	chr22	ATXN10	MOTIFS = ATTCT; STRUC = (ATTCT)n
E	chr12	ATXN2	MOTIFS = GCT; STRUC = (GCT)n
F	chr14	ATXN3	MOTIFS = GCT; STRUC = (GCT)n
G	chr3	ATXN7	MOTIFS = GCA, GCC; STRUC = (GCA)n(GCC)n
H	chr13	ATXN8OS	MOTIFS = CTA, CTG; STRUC = (CTA)n(CTG)n
I	chr9	C9ORF72	MOTIFS = GGCCCC; STRUC = (GGCCCC)n
J	chr19	CACNA1A	MOTIFS = CTG; STRUC = (CTG)n
K	chr3	CNBP	MOTIFS = CAGG, CAGA, CA; STRUC = (CAGG)n(CAGA)n(CA)n
L	chr19	DMPK	MOTIFS = CAG; STRUC=(CAG)n
M	chrX	FMR1	MOTIFS = CGG, AGG; STRUC=(CGG)n
N	chr9	FXN	MOTIFS = A, GAA; STRUC = (A)n(GAA)n
O	chr4	HTT	MOTIFS = CAG, CCG; STRUC = (CAG)nCAACAG(CCG)n
P	chr14	PABPN1	MOTIFS = GCG; STRUC = (GCG)n
Q	chr5	PPP2R2B	MOTIFS = GCT; STRUC = (GCT)n
R	chr4	RFC1	MOTIFS = AAAAG, AAAGG, AAGGG, AAGAG, AGAGG, AACGG, GGGAC, AAAGGG; STRUC = <RFC1>
S	chr6	TBP	MOTIFS = GCA; STRUC = (GCA)n
T	chr18	TCF4	MOTIFS = CAG; STRUC = (CAG)n

20개의 DNA 반복서열을 multiplex PCR (10~12 kb)로 증폭한 후 Native Barcoding Kit 96 V14 (Oxford Nanopore Technologies)로 NGS library를 제작하여 GridION (Oxford Nanopore Technologies) 으로 분석하였다.
PrimeSTAR^® LongSeq으로 증폭한 산물은 다른 long-read PCR 효소로 증폭한 산물보다 타겟에 대한 1차 리드 (primary read) 비율이 더 높았다 (그림 6). 추가 분석 결과 PrimeSTAR^® LongSeq으로 증폭한 산물은 우수한 시퀀싱 coverage와 높은 균일성을 나타낸 반면, 타사 제품들은 다양한 타겟에 대한 시퀀싱 coverage가 없거나 극히 낮은 depth를 나타내었다 (그림 7).

PrimeSTAR^® LongSeq을 사용하여 bias를 줄이면서 균일한 증폭을 진행할 수 있고 최적화된 multiplex 반응을 설계할 수 있어 소량의 샘플로도 시퀀싱 분석이 가능할 것으로 기대한다.



그림 6. 타사 대비 높은 on-target primary read 비율 (GridION 플랫폼 사용)
PrimeSTAR^® LongSeq은 99% 이상의 on-target 증폭율을 보였고, 이는 long-range multiplex PCR 에서도 매우 특이적으로 증폭이 잘 이루어졌음을 의미한다.



그림 7. 타사 대비 균일한 20-plex PCR amplicon의 시퀀싱 coverage (GridION 플랫폼 사용)
패널 A. NGS 분석 결과, PrimeSTAR^® LongSeq (P)을 사용한 multiplex 증폭산물은 20개 모두에서 타겟 서열의 전체 영역을 균일하게 증폭하는 데 성공하였다. 반면, 타사 long-range PCR 효소 (N, T)는 다수의 타겟에 대해 depth가 없거나 극도로 낮은 depth의 결과를 보였다.
패널 B. Depth 균일성에 대한 정량 분석 결과, PrimeSTAR^® LongSeq을 사용하여 20개 타겟 모두에서 full-length 서열을 얻었음을 추가로 확인하였다 (n=40, 2반복). 반면 타사 long-range PCR 효소는 타겟의 53~68%에 대해서 만 full-length 서열을 얻을 수 있었고, 이는 시퀀싱 read 수를 늘려도 결과가 크게 개선되지 않았다 (data not shown).

■ Conclusions
PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase는 최대 53 kb까지의 long-range PCR에서 타사 동종제품 대비 우수한 성능을 발휘하였다. (1) GC/AT rich 서열 증폭, (2) GC rich 서열과 AT rich 서열을 동시에 증폭하는 multiplex PCR, 그리고 (3) 4℃ 에서 17시간 또는 실온에서 1시간 경과 후 GC/AT rich 서열을 증폭해도 모두 높은 정확도를 유지하였다.
20종의 DNA 반복서열에 대한 multiplex PCR에서 PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase는 탁월한 시퀀싱 coverage와 균일한 depth를 보였으며, Oxford Nanopore Technologies의 long-read NGS 분석을 통해 시중에 판매중인 타사 long-range PCR 효소보다 현저히 우수한 결과를 보이는 것을 확인하였다.

■ Methods
모든 PCR 반응은 human genomic DNA (100 ng / 50 ㎕ 반응)와 Clontech PCR Thermal Cycler GP (Code WN400)를 이용하여 각 제조사의 권장 매뉴얼에 따라 진행하였다.

■ Reference
Ibanez, K. et al. Increased frequency of repeat expansion mutations across different populations. Nature Medicine 30, 3357-3368 (2024).

본 연구에 사용된 ultra long-range PCR 효소 PrimeSTAR LongSeq DNA Polymerase (Code R055A) 제품 확인하기