■ Introduction

• 용해성 microfluidics 기술로 다양한 세포 유형에서 lentiviral transduction 효율 향상
• Spinoculation 방법 이상의 높은 효율의 transduction
• 쉬운 workflow로 cell handling과 hands-on time을 최소화
• 다양한 cell type (cell lines and primary cells 포함)에 적용 가능한 넓은 범용성
• Sponge 1개 당 105~107 cell에 해당하는 넓은 범위의 세포 양 transduction 가능

많은 연구자들이 lentivirus의 낮은 transduction 효율로 어려움을 겪으며, 이는 후속 실험에 큰 영향을 미칠 수 있다. Lentiviral vector는 유전자 및 단백질 발현, 세포주 개발, 치료 모델 생성, 전장 유전체 스크리닝 (WGS), CAR-T 연구 등 다양한 응용 분야에서 유전자를 타겟 세포로 전달하는 데 사용되는 도구다. Transduction 효율을 향상시키기 위해 spinoculation 이나 chemical 기반 enhancer로 세포와 바이러스의 접촉을 높이는 것이 필요하지만, 이 방법에는 한계가 있다. Microfluidic 시스템은 세포와 바이러스를 가까이 두어 공간적으로 제한시켜, transduction 효율을 올려 기존 방법의 한계를 극복할 수 있다. 그러나 이전의 microfluidics 기반 lentiviral transduction은 세포와 바이러스의 흐름을 원활히 하기 위해 고가의 시스템이 필요했다. 연구에 따르면 microporous (다공성) 3D alginate sponge는 별도의 기기와 chemical 시약 없이도 독성없이 바이러스 transduction 효율을 높일 수 있다.

■ Lenti-X™ Transduction Sponge
Microfluidic sponge는 생체 적합성이 높고 독성이 낮다고 알려진 생체재료인 calcium-crosslinked alginate로 만들어 졌다. Crosslinked alginate (가교 알긴산염)을 cryogelation (냉동젤화) 과정을 거쳐 20~300 ㎛의 균일한 pore 사이즈를 가진 sponge로 제작하였다.

Workflow는 세포와 바이러스의 혼합물을 sponge에 넣고, 1시간 동안 짧게 배양하여 흡수시킨 뒤, media를 추가하여 다음 날까지 배양한 후 회수하는 간단한 과정이다. 다음 날, sponge를 용해시키는 chelating release buffer를 sponge에 추가하여 transduction 된 세포를 회수할 수 있다.

Workflow 및 제품 형태

Figure 1. Lenti-X™ Transduction Sponge를 사용해 간단한 transduction workflow.
Sponge에 추가하기 전 타겟 세포와 lentivirus를 혼합 (총 부피 최대 150 ㎕)하고 24 well plate에 담긴 sponge 위에 dropwise 방식으로 첨가 및 흡수, 1시간 반응한다. 37 ℃의 CO₂ 인큐베이터에서 1시간동안 반응 후 well에 배지를 추가로 1 ㎖ 첨가한 후, 인큐베이터에서 16~24시간 배양한다. Spinoculation 과정 없이, 다음 날 Release Buffer를 첨가하여 sponge의 알긴산 구조를 녹여내 transduction된 건강한 세포를 회수한다. 회수된 세포는 후속 분석에 사용되거나 추가 배양할 수 있다.


Figure 2. 24-well tissue culture plate에 넣어 함께 사용하기 편리한 형태로 공급
Panel A. 개별 포장된 24개의 sponge는 각 1 x 10⁵cells을 transduction할 수 있다.Panel B.
각 sponge는 복잡한 다공성의 20~300 ㎛의 microfluidics 구조를 가지며, 본 이미지는 150배 확대 사진이다.Panel C.샘플을 추가하기 전 sponge를 24 well plate에 옮기는 장면이다. Panel D. 
1 x 10⁵~1 x 10⁷ cells 과 virus가 포함된 transduction mix를 sponge에 추가하여 1시간 반응 후, media를 추가로 넣은 이후 인큐베이터에서 16~24시간 배양한다. Panel E. 배지와 sponge를 모두 15 ㎖ 튜브로 옮기고 Release Buffer를 첨가하여 원심분리하면 sponge가 용해된다. 용해 후 방출된 세포를 wash하여 회수한다.

Spinoculation 방법과 sponge transduction 효율 비교

Figure 3. Lenti-X™ Transduction Sponge는 다양한 세포에서 spinoculation (with polybrene)방식보다 동등 이상의 고효율 transduction 가능.
Panel A. 1 X 10⁶ Jurkat 세포에 spinoculation과 Lenti-X™ Transduction Sponge 방법으로 ZsGreen1을 발현하는 lentivirus를 MOI 0, 1, 5, 10으로 transduction한 결과이다. Spinoculation은 cell과 polybrene 8 ㎍/㎖을 함께 32℃에서 1,400 xg 로 90분간 원심분리하였고, Lenti-X™ Transduction Sponge는 제품의 사용자메뉴얼에 따라 진행하였다. 두 방법 모두 transduction 48시간 뒤 ZsGreen1의 발현율을 FACS로 분석하여 정리하였다. 그 결과 Lenti-X™ Transduction Sponge가 spinoculation 방법보다 간편하고 더욱 효과적이었다. Panel B. ZsGreen1 발현 lentivirus를 panel A와 동일한 방법으로 다양한 cell line에서 transduction한 결과이다. 다양한 세포에서 Lenti-X™ Transduction Sponge는 spinoculation 방법과 동등하거나 더 효과적이었다.


그림 4. Lenti-X™ Transduction Sponge를 사용하면 primary T cell의 viability를 유지하면서 transduction 효율을 높일 수 있다.
Panel A. Human primary T cell을 MHC tetramer, antiCD3/CD28-coated bead, RetroNectin+CD3, CD3를 각각 사용하여 활성화시켰고, 48시간 뒤 CD69+의 발현을 측정하여 활성화 정도를 측정하였다. 이후 1 x 10⁶ 개의 활성화된 세포에 Lenti-X™ Transduction Sponge를 사용해 24시간 동안 ZsGreen1을 발현하는 lentivirus로 transduction하고, 48시간 후 FACS로 ZsGreen1의 발현율을 측정하여 %로 정리한 결과이다. Panel B. Transduction 48시간 후 7-AAD 염색과 FACS를 사용해 viability를 측정한 결과, T cell에서 높은 viability를 확인할 수 있었다.

일관된 transduction 효율
Sponge 기반의 transduction 방법은 다양한 세포 양 (1x10⁵~1x10⁷cells) 및 세포 유형, 용량 (50~150 μl), 배양 시간 (4~16 시간) 등 다양한 조건에서도 재현성을 나타낼 만큼 유연성이 뛰어나다. 이 방법은 변동계수가 15 % 미만으로 일관성 있는 결과를 얻을 수 있다.


Figure 5. Lenti-X™ Transduction Sponge는 다양한 조건에서 일관된 높은 효율의 재현성을 보인다.
Panel A. Jurkat cell에 RetroNectin & spinoculation (RN & spin) 프로토콜과, transduction sponge 사용하여 24시간 동안 배양하여, 다양한 세포 수와 MOI에서 ZsGreen1을 발현하는 lentivirus를 transduction한 결과이다. Panel B. 다양한 수의 Jurkat cell에 ZsGreen1을 발현하는 lentivirus (MOI = 10)를 transduction sponge를 사용하여 4, 9, 24 또는 48 시간동안 transduction한 결과이다. Panel C. Jurkat cell 1 x 10⁶ cells에 ZsGreen1을 발현하는 lentivirus (MOI = 2.5)를 4주 동안 매주 6회 반복하여 transduction하여 실험 간의 변동성 (%CV = 12.6)을 평가하였다. 모든 실험에서 transduction 이후 %ZsGreen positive 세포와 MFI를 확인하였으며, ZsGreen1 발현 평균값은 빨간색 (AVG)으로 표시하였다.
세포 수, transduction 시간, sponge 간의 실험 변동성을 확인한 결과, 모든 조건에서 일관되게 높은 효율로 transduction된 것을 확인하였다.

■ Conclusions
사용자 친화적인 transduction enhancer인 Lenti-X™ Transduction Sponge는 혁신적인 체외 용해성 microfluidics 기술로, 다양한 세포 유형에 적용가능하며 높은 효율을 제공한다.

• Sponge 사용 결과 spinoculation 방법보다 더 나은 transduction 효율 확인
• 간단한 workflow로 cell handling과 hands-on time을 최소화; 오염 및 에러 감소
• CD34 HSCs, NK cells, T cells을 포함한 다양한 세포 유형에 고효율 transduction 가능
• 넓은 범위의 세포 양 (sponge 당 1x10⁵~1x10⁷ cells)을 적용 가능하여 많은 수의 transduced 세포가 필요한 후속 실험에 활용 가능

■ 관련제품
- 다양한 cell-line과 Transduction이 어려운 primary cell에 적용 가능 : Lenti-X™ Transduction Sponge (Code 631478)
- T cell 전용, activation과 transduction을 동시에 : Lenti-X™ T-Cell Transduction Sponge (Code 631480)
- 빠르고 간단하게 Lentivirus 정량, 10분 완성 : Lenti-X™ GoStix™ Plus (Code 631280)
- 고역가 lentivirus 생산을 위한 최적의 비율 : Lenti-X™ Packaging Single Shots (VSV-G) (Code 631275 외)
- 세포 오염물질을 제거하여 더욱 효과적인 형질도입 : Lenti-X™ Maxi Purification Kit (Code 631233 외)
- 세포배양 시 반드시 mycoplasma 오염 확인 필수 : MycoAlert PLUS Mycoplasma detection kit (Code LT07-701 외)