1. Expression vector 선택
1) pNI DNA
pNI DNA는 분비성 발현 벡터인 pNCMO2 DNA (Code HB112)의 분비 시그널 부분을 제거해, 세포 내에 발현 생산물이
축적되도록 만들어진 세포 내 발현용 벡터이다. 그 이외의 기본적인 구조는 pNCMO2 DNA와 같다. 이 vector는
Brevibacillus와 E. coli shuttle vector로, E. coli에서 expression plasmid를 구축한 후,
발현 분석을 위해 Brevibacillus로 도입하여 사용할 수 있다. pNI DNA의 expression promoter는 숙주 세포벽
단백질 유래의 P2 promoter를 이용하고 있다. P2 promoter는 E. coli에서는 활성이 약하기 때문에, 목적 유전자의
cloning에 유용하다. 한편, Brevibacillus에서는 매우 강한 promoter활성을 가지고 있다. 따라서 Brevibacillus에서
효율적인 단백질 생산에 적합하다.
2) pNI-His DNA
pNI-His DNA는 Ni-resin으로 발현 산물을 간단하게 정제할 수 있는 세포 내 expression vector로써, His-tag (6×His)
서열과 tag 제거를 위한 enterokinase 인식 서열이 포함되어 있다. 그 외 vector 구조는 pNI DNA와 같다.
[pNI DNA의 vector map]
pNI DNA의 경우는 Nco I 로 시작하는 multi cloning site (MCS)에 목적 단백질의 유전자를 삽입한다.
만약 Nco I 제한효소 site를 사용할 수 없는 경우에는, MCS 서열에서 발현되는 아미노산이 목적 단백질에 추가되진 않지만,
사용하는 제한효소 site에 따라 여분의 아미노산이 N말단이 추가된다.
pNI-His DNA의 경우에는 목적 단백질의 유전자는 BamH I 이후의 위치에 삽입한다.
3. Brevibacillus 형질전환
Brevibacillus의 형질전환은 electroporation으로 할 수 있다. 선택 표지는 neomycin resistance gene을 사용한다.
Shuttle vector로 E. coli에서 사용할 경우에는, ampicillin resistance gene을 사용할 수 있다.
4. 발현산물 검출과 스케일 업
Negative control을 동시에 배양해 원하는 목적 단백질의 발현을 확인한다. 목적 단백질 유전자가 도입된 형질 전환체를
액체 배양 배지에서 48~64시간 동안 진탕 배양시켜 목적 단백질을 얻을 수 있다. 배양 산물을 SDS-PAGE 등으로 발현의 유무를
확인할 수 있다. 많은 생산량이 필요한 경우에는 Brevibacillus가 대규모 배양이 비교적 용이하기 때문에 스케일 업하여 배양하면 된다.
