• SSv4를 기반으로, 다량의 샘플 분석 및 자동화 적용에 최적화
• Easily automate the streamlined workflow - 적은 시간으로 더 많은 샘플 분석 가능
• Unparalleled sensitivity - Single cell 또는 10 pg total RNA에서 분석 가능 (Input range: 1 - 100 cells or 10 pg - 1 ng of total RNA)
• Single-tube workflows - cDNA 합성부터 library 과정을 각각 single tube에서 진행할 수 있어, 샘플 손실이나 오염 등 실험 과정에서 발생할 수 있는 오류 최소화
• Increase your sequencing power - 많은 샘플을 분석할 수 있는 Unique dual index (UDI) 사용
• High library yield - 높은 yield의 library를 제작할 수 있어, NovaSeq™ system과 같은 high-throughput sequencer에 적용하거나, 여러 차례 분석 가능

제품설명

SMART-Seq^® HT Kit (SSv4-HT)와 SMART-Seq^® HT PLUS kit (SSv4-HT PLUS)는 극소량의 세포나 RNA 샘플을 대량(High-throughput)으로 분석할 수 있는 제품이다. SSv4-HT PLUS 제품을 이용하면, 10 pg - 1ng total RNA 또는 1 - 100개의 세포에서 RNA 추출 과정 없이, oligo(dT) primer를 이용한 고품질 full-length cDNA를 제조한 후, lllumina^® 플랫폼의 라이브러리 제작까지 진행할 수 있다.
본 제품은 SMART (Switching Mechanism at 5' End of RNA Template) 기술에 Locked Nucleic Acid (LNA) 기술을 접목함으로써 template switching의 효율을 더욱 향상시켰다. 따라서, 이전 세대의 제품보다 더욱 많은 수의 유전자수를 검출할 수 있어 전반적인 전사체 연구 (full transcriptome analysis)에 있어 매우 유용하다. 또한, SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing (Code 634888)의 기술을 기반으로 하고 있어 동일한 성능의 민감도 (sensitivity)와 재현성 (reproducibility)를 보일 뿐 아니라, FACS sorting 이후 실험 단계를 최적화하여, hands-on time을 감소시킴으로써 편리성을 높였다.
SMART-Seq^® HT PLUS kit (SSv4-HT PLUS)에 포함되어 있는 library preparation kit는 enzymatic fragmentation와 stem-loop adaptor를 함께 사용하여, 2시간 내 single tube에서 purification 과정 없이 cDNA로부터 library로 제작할 수 있다. 따라서 샘플의 손실이나 오염 등 실험 과정에서 발생할 수 있는 오류를 최소화 할 수 있다. 이 과정을 통해 제작된 library는 SMART-Seq2 등 기존의 방법 및 당사 기존 제품 (SMART-Seq^® v4)에 비해 재현성이 높고, 훨씬 우수할 뿐 아니라, 높은 yield로 제작되어 high-throughput sequencer에 적용하거나, 여러 차례 분석할 수 있다.


그림 1. SMART기술을 이용한 cDNA 합성 과정


그림 2. Comparison of the SMART-Seq v4 and SMART-Seq HT kit workflows
(왼쪽) SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing (Code 634888)
(오른쪽) SMART-Seq^® HT Kit (Code 634437) (오른쪽)은 기존의 SMART-Seq^® v4 (왼쪽)의 프로토콜을 변형함으로써, 보다 간편하고 빠르게 High-throughput으로 NGS Library를 제작할 수 있다. FACS sorting으로 Single cell 분리 후, SMART-Seq^® v4의 경우는 총 6번의 Hands-on step이 필요한 데 반하여, SMART-Seq^® HT Kit의 경우는 단 3번의 Hands-on step으로 cDNA 합성을 완료할 수 있다.


그림 3. FACS로 분류한 293T cells을 SMART-seq^® v4과 SMART-Seq^® HT kits를 이용해 분석했을 때, 높은 재현성과 유전자 발현 확인

Libraries generated from twenty-one individual 293T cells (table, top panel) were further analyzed to evaluate the reproducibility of gene expression measurements obtained for each cell with the SMART-Seq^® v4 kit (SSv4_1 to SSv4_12) and the SMART-Seq^® HT Kit (HT_1 to HT_9) (lower panel). The hierarchical clustering heat map shows Euclidean distances between all the cells and reports Pearson correlations ranging from 0.74 to 0.97. While the best correlations are observed between cells prepared with one or the other kit, the correlations are still very high between the two kits and the cells are not clustering based on the library preparation method. These data demonstrate that the modified workflow in the SMART-Seq^® HT Kit does not introduce major bias in measurement of gene expression levels.


그림 4. SMART-Seq v4와 SMART-Seq HT kit로 분석했을 때의 유전자 GC content 발현 비교

The libraries made from 10 pg of Mouse Brain Total RNA shown in the table (Figure 2) were further analyzed for GC content representation (see table, top panel). Genes were binned by GC content, and correlation plots were used to visualize the reproducibility of the expression levels (FPKM) of genes in each bin. The average gene counts are very reproducible for replicate samples analyzed using the SMART-Seq^® v4 (Panel A) or SMART-Seq^® HT kits (Panel B). Genes with high or low GC content (shown in red and blue, respectively) show similar expression levels in the SMART-Seq^® v4 and SMART-Seq^® HT kits (Panel C). Thus, the One-Step RT PCR reaction introduced in the new SMART-seq^® HT Kit maintains the representation of the low- and high-GC content genes


그림 5. High overlap of transcripts identified with the SMART-Seq v4 and SMART-Seq^® HT kits
Libraries prepared from 10 pg of Mouse Brain Total RNA shown in Table 1 were further evaluated for the overlap in the number of transcripts identified (FPKM >0.1) between technical replicates within each kit, and found to be very similar (61-63% overlap) (Panel A). Transcripts identified by all three replicates for each kit were then compared against each other, indicating an overlap of 71%. The overlapping transcripts have an average expression level of 37 FPKM, while the transcripts uniquely identified with individual kits are less abundant, averaging between 6-7 FPKM, indicating that the transcripts more likely to not be identified are the ones expressed at a low level.


그림 6. SSv4-HT PLUS를 이용한 library에서 Nextera^® XT보다 더 높은 yield와 유전자 검출

(Panel A) SMART-Seq^® HT was used to produce cDNA from 10 pg of Mouse Brain Total RNA in triplicate. Illumina^®-compatible libraries were generated using SMART-Seq^® PLUS or Nextera^® XT (Illumina^®) library prep kits, and sequenced on a NextSeq 500 system. The reads were normalized to 4M paired-end reads and analyzed as described in the technical note.
(Panel B) Library yields obtained with SMART-Seq^® Library Prep Kit are higher than those generated with Nextera XT.
(Panel C) The SMART-Seq Library Prep Kit identified 10% more genes than Nextera^® XT.

적용

자세한 구성은 CoA를 참고하세요.