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Home > 전제품보기 > cDNA 합성 > in-vitro transcription > Faustovirus Capping Enzyme (S17)
다양한 온도에서 반응할 수 있는 Capping enzyme

Faustovirus Capping Enzyme (S17)

-

제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)
비고 사용자매뉴얼
Takara
2480A
Faustovirus Capping Enzyme (S17)
관련학술 구매하기
500 U
160,000원  2480a_ds_j.pdf
Takara
2480B
Faustovirus Capping Enzyme (S17)
관련학술 구매하기
2,000 U (2480Ax4)
576,000원 

제품설명
Faustovirus Capping Enzyme (S17) (;FCE)은 Faustovirus S17균주 유래의 효소로 단일 subunit을 가진 단백질이다. 이 효소는 기존에 사용되던 vaccinia 바이러스 유래의 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A) (;VCE)과 유사한 작용 기전을 가지고 있어 RNA (5'-triphosphate RNA)의 5’ 말단에 7-methylguanylate cap 구조 (Cap 0)를 부가하는 활성을 가진다. 이 효소를 사용하면 IVT에서 효과적으로 완전한 Cap 0 구조를 가지는 RNA를 합성할 수 있고 여기에 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)를 같이 사용하면 Cap 0의 구조 RNA에서 첫번째 뉴클레오타이드의 2’-O 부분을 메틸화하여 Cap 1의 구조의 RNA를 single step으로 합성하는 것 역시 가능하다*.

Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)보다 다양한 온도에서 높은 활성을 보이고 (30~50℃) (그림 1), 다양한 RNA에 적용 가능하기 때문에 mRNA 백신 및 치료제 등 분야의 연구 개발에 유용하다.

*Uncapped RNA를 1 step으로 Cap-1 RNA로 합성하고자 하는 경우, mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)에 포함된 버퍼 대신 Faustovirus Capping Enzyme에 포함된 10×Capping Buffer 2 를 사용하세요.


그림 1. 반응온도에 따른 FCE와 VCE의 capping 효율
FCE와 VCE 두 종류의 capping enzyme을 사용해 다양한 온도에서 capping 반응을 진행하고 LC/MS로 capping 효율을 (Cap 0 비율)을 측정했다. 그 결과 FCE가 VCE보다 넓은 온도 범위에서 높은 capping 효율을 보였다.
용도
- Cap 0 구조를 갖는 mRNA 합성
- mRNA Cap 2-O-Methyltransferase와 병용하여 Cap 1 구조를 갖는 mRNA 합성
내용

구성품

용량

Faustovirus Capping Enzyme (S17) (25 U/μl)

500 U

10×Capping Buffer 2

100 ㎕

S-adenosylmethionine (SAM) (32 mM)

100 ㎕

GTP (10 mM)

50 ㎕

보존: -20 ℃
농도: 25 U/㎕
기원
Escherichia coli carrying a plasmid containing the gene for Faustovirus capping enzyme (S17)
일반적인 성질
- 분자량: 약 100 kDa
활성의 정의
37 ℃에서 30분 동안 5 pmol의 100 nt 전사체를 Cap 0 RNA로 전환시키는 효소의 양을 1U으로 한다.
활성 측정용 반응액의 조성

1 x

 

Capping Buffer 2

25 ㎕

 

GTP

20 μCi/㎖

 

[3H]SAM

2.5 ㎍/50 ㎕

 

100 nt RNA

사용 예
1. Uncapped RNA (5’-triphosphate RNA)에서 Cap 0/Cap 1 RNA 합성 [2 step reaction]

RNA transcript (50 ㎍)*1

 

38 ㎕

10x Capping Buffer 2

 

5 ㎕

GTP (10 mM)

 

2.5 ㎕

SAM (2 mM, dilute 32 mM stock to 2 mM)*2

 

2.5 ㎕

Faustovirus Capping Enzyme (S17)*3

 

2 ㎕

Total

 

50 ㎕ *4

37℃에서 30분 incubation*3
이어서 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)로 Cap 1 RNA 합성 가능

2. Uncapped RNA (5’-triphosphate RNA)에서 Cap 1 RNA 합성 [1 step reaction]

RNA transcript (50 ㎍)*1

 

34 ㎕

10x Capping Buffer 2

 

5 ㎕

GTP (10 mM)

 

2.5 ㎕

SAM (4 mM, dilute 32 mM stock to 4 mM)*2

 

2.5 ㎕

Faustovirus Capping Enzyme (S17)*3

 

2 ㎕

mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase (50 U/㎕)*3

 

4 ㎕

Total

 

50 ㎕ *4

37℃에서 30분 incubation*3

*1 RNA (5’-triphosphate RNA)의 5’말단이 복잡한 2차 구조를 가진 경우 반응 전 열로 변성시키는 것으로 capping 효율이 높아질 수 있다.
<열 변성>
    (1) 정제된 RNA 50 ㎍을 RNase free water로 38 ㎕ (Cap 0 RNA 합성) 혹은 34 ㎕ (Cap 1 RNA 합성)로 희석한다.
    (2) 65℃에서 5~10분 열변성 후 5분동안 얼음에서 incubation한다.
*2 SAM은 불안정한 물질이기 때문에 반응 전 필요한 양을 미리32mM stock solution에서 RNase free water로 희석하여 사용한다. 희석된 시약은 반응 전까지 얼음 위에서 보관한다.
*3 RNA의 capping 효율이 낮은 경우 효소의 사용량을 늘리거나 반응 시간을 늘린다.
*4 반응액의 부피는 필요에 따라 스케일업 가능하다.
*5 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)에 포함된 버퍼가 아니라 Faustovirus Capping Enzyme (S17)에 최적화된 버퍼 (10×Capping Buffer 2)를 사용해야 한다.
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Keyword :

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