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mRNA 구조체 스크리닝에 사용

Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA

제조사	제품코드	제품명	용량	가격 (부가세별도)	비고	사용자매뉴얼
Takara	3288	Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA	10 회	598,000원

Product index

in vitro transcription

세포 배양 없이, mRNA 첨가만으로 간편하게 단백질 합성이 가능한 cell-free 단백질 합성 시약
Human cell line 유래의 세포 추출액을 사용, human 세포와 유사한 단백질 합성을 재현
코돈 최적화 및 mRNA 안정성 향상을 위한 IVT mRNA의 최적 서열 확인에 활용

제품설명

본 제품은 mRNA로 cell-free 단백질 합성을 위한 시약이다. 이 제품에는 human 세포 유래 리보솜, 번역 개시 및 신장 인자, tRNA 등 단백질 번역에 필요한 모든 성분이 포함되어 있어, 단백질을 암호화하는 capped mRNA를 첨가하고 32 ℃에서 몇 시간 동안 단일 튜브 내에서 반응하는 간단한 절차로 단백질을 합성 할 수 있다. 기존 세포에서 직접 발현하는 실험에 비해 번거로운 세포 배양 없이, 신속하게 목적 단백질 발현과 mRNA 구조체 평가를 진행할 수 있으므로, 백신 개발 등의 용도로 설계된 IVT mRNA 구조체 스크리닝에 적합하다.

※1: 단백질 발현을 위해서는 mRNA에 cap 구조가 반드시 필요하다.
Capped mRNA는 cap analog를 사용하여 Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA) (Code 6134)로 합성하거나, Faustovirus 유래의 capping 효소 (Faustovirus Capping Enzyme (S17), Code 2480A외) 및 2’-O- Methyltransferase (mRNA Cap 2-O-Methyltransferase, Code 2470A 외)를 사용하여 합성한다.
※2: 권장 조건. 반응 최적 온도와 시간은 mRNA 구조체 (목적 단백질)에 따라 다름

적용 예시

1. mRNA를 이용한 분자량이 다른 3종류의 cell-free 목적 단백질 발현 (elF4G: 170 kDa, FLuc: 61 kDa, ZsGreen: 26 kDa)

그림 1-A. mRNA input 양에 따른 단백질 발현 비교
Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA에 3종류의 capped mRNA^*3와 non-capped mRNA를 각각 1, 2, 4 μg씩 첨가한 뒤, 32 ℃에서 3시간 동안 반응하였다. 그 결과, capped mRNA를 첨가한 조건에서만 목적 단백질의 높은 발현이 확인되었으며(SDS-PAGE: eIF4G, FLuc-빨간색 화살표 / 발광 측정: FLuc, 형광 측정: ZsGreen), mRNA를 2 μg 첨가했을 때 단백질 발현이 가장 높게 나타났다.

그림 1-B. 반응 시간에 따른 단백질 발현
3종류의 capped mRNA^*3와 non-capped mRNA를 각각 2 μg씩 첨가하여 32 ℃에서 0, 1, 2, 3, 5시간 동안 반응했다. 그 결과, capped mRNA를 첨가한 조건에서만 목적 단백질의 높은 발현이 확인되었으며, 단백질에 따라 최적 반응 시간은 (eIF4G: 3~5시간, FLuc: 2시간, ZsGreen: 5시간) 다르게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.

그림 1-C. 반응 온도에 따른 단백질 발현
3종류의 capped mRNA^*3를 각 2 μg씩 첨가하여 27℃, 32℃, 37℃에서 3시간 동안 반응했다. 그 결과, eIF4G는 27℃ 또는 32℃, FLuc는 27℃, ZsGreen은 32℃에서 반응 최적 온도임을 확인하였고, 최적 반응 온도가 목적 단백질에 따라 다르게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.

^*3 Cloning Kit for mRNA Template (BspQ I) (Code 6133), Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144) 및 CleanCap Reagent AG (3'OMe) (TriLink)를 사용

2. Cell-free 발현과 세포 발현의 상관관계

그림 2-A. 서로 다른 3' UTR 서열을 가진 FLuc mRNA 준비

FLuc (Firefly Luciferase) mRNA의 유전자 하류에 인간 α-globin, β-globin, AES 유래 3’ UTR 서열 및 간염 바이러스 유래 WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) 서열을 각각 삽입하였다. 이때 5’ UTR, FLuc, Poly(A) 서열은 모두 동일한 염기서열을 사용하였다. 해당 DNA 서열을 주형으로 하여 Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)와 CleanCap AG (3’ OMe) (TriLink)를 사용해 각각 capped mRNA를 합성하였다.

그림 2-B. FLuc 단백질의 cell-free 발현과 세포 내 발현 간의 비교

Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA에 각 capped FLuc mRNA를 2 μg씩 첨가하여 27 ℃에서 2시간 동안 반응하였고, 세포 내 발현은 동일한 mRNA (0.5 μg)를 TransIT-mRNA Transfection Reagent (Code MIR 2225)로 HEK293T 세포와 HeLa S3 세포에 각각 transfection한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후에는 FLuc 단백질의 활성을 화학발광 방식으로 측정하였다. 그 결과, cell-free 발현계와 세포 발현계 간의 FLuc 단백질 발현 (활성) 수준은 높은 상관관계를 보였으며, HEK293T에서는 R²=0.87, HeLa S3에서는 R²=0.70으로 나타났다. 이 결과는 mRNA 기반 cell-free 단백질 발현 시스템이 mRNA 구조체의 신속하고 효율적인 평가 및 스크리닝에 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.

용도

1. 설계한 mRNA 구조체의 스크리닝
2. 독성 단백질의 cell-free 합성

내용

Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA　　　180 ul

보관온도

－80 ℃
(주의사항: 본 제품은 수령 후 즉시 -80 ℃에서 보관해 주십시오. -8 0℃보다 높은 온도에서 보관하면 성능이 저하될 수 있습니다. 또한, 한번에 다 사용하지 않을 경우, 동결ㆍ융해로 인한 성능 저하를 피하기 위해 처음 해동 시 소량씩 나누어 보관하는 것을 권장합니다.)

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Keyword :

in vitro transcription

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mRNA 구조체 스크리닝에 사용

Human Cell-Free Protein Expression Master Mix for mRNA

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