· TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit (Code 9765A)
이 제품은 식물, 전혈(whole blood), 배양된 세포와 그람 음성 세균(Gram-negative bacteria)으로부터 genomic DNA를 정제하기 위한 제품으로, genomic DNA의 수율은 샘플에 따라 차이가 있습니다. 일반적으로, 25 ㎎의 간 조직(liver tissue)에서 약 15 ㎍, 100 ㎎의 시금치(Spinach)에서 약 10 ㎍의 genomic DNA를 추출할 수 있습니다. 또한, 100 ㎕의 사람 전혈에서는 0.5 ㎍, 2.0 x 10^6의 배양 세포에서는 10 ㎍, 대장균 2.0 x 10^9에서는 10 ㎍의 고순도 genomic DNA를 추출 가능합니다.

· TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 (Code 9763A)
다양한 세균에서 genomic DNA를 추출하는 제품으로 genomic DNA의 수율은 추출하는 샘플에 따라 다릅니다. 일반적으로, 2.0 x 10^9의 세균에서 5 - 15 ㎍의 genomic DNA를 추출할 수 있고, E. coli JM109, 2.0 x 10^9에서는 10 ㎍, Staphylococcus aureus 2.0 x 10^9에서는 6 ㎍의 genomic DNA를 추출할 수 있습니다.

· TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 (Code 9766A)
다양한 샘플로부터 virus RNA/DNA 정제하기 위한 제품으로, 6.0 x 10^4 copies의 HAV 와 1.0 x 10^5 copies의 rabies virus의 Flury strains에서 RNA 추출이 가능합니다.

· TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit (Code 9768A)
식물조직에서 genomic DNA 정제에 적합한 제품으로, genomic DNA의 수율은 샘플에 따라 다르며, 일반적으로, 100 ㎎의 식물조직에서 1 - 10 ㎍의 genomic DNA를 추출할 수 있습니다. 일반적으로 식물조직의 DNA 함량은 낮으며, 특히 과일은 많은 수분을 포함하고 있어 일반 식물조직보다 DNA 함량이 낮습니다. 식물의 DNA 함량은 성장 과정과 매우 밀접하기 때문에, 어린 식물(young plant material)을 사용하면 고품질 DNA를 얻을 수 있습니다.

(1) 샘플을 오래 보관했거나, 보관 온도가 맞지 않은 경우 Genomic DNA가 분해될 수 있습니다. 샘플은 -80℃에서 보관하며 이동시 드라이 아이스를 사용합니다.
(2) 샘플에 DNase가 잔존하는 경우입니다. Buffer WA를 이용해 washing합니다.
(3) 추출한 genomic DNA를 장시간 동안 보관할 경우, Elution buffer에서 보관합니다.

(1) RNase A가 처리되지 않은 경우입니다. RNase A를 사용하는 실험방법을 참고하세요.
(2) RNase A가 비활성상태인 경우입니다. 일반적으로 RNase A는 -20℃에서 보관합니다. RNase A의 활성은 안정적이며 쉽게 비활성화되지 않습니다.

(1) 추출된 genomic DNA의 염(salt)농도가 너무 높은 경우.
Buffer WA와 Buffer WB를 사용하여 DNA preparation membrane을 washing할 때 spin column tube의 벽면을 따라 첨가합니다. Washing 효과를 향상시켜 남아있는 염(residual salt)을 완전히 제거합니다(상온에서 5분).

(2) Lysate에 ethanol이 존재한 경우.
Column에 Elution buffer를 넣어주기 전, 상온에 2분 동안 column을 두면 잔존 ethanol이 제거되어 elution의 효과를 향상시킬 수 있습니다.

(3) Elution buffer나 RNase free dH2O(viral DNA/RNA 경우)는 DNA elution단계에서 column membrane 중앙에 넣어주어야 합니다.

본 제품은 소량의 genomic DNA를 정제하도록 제작되었습니다. 샘플의 양이 매뉴얼에서 권장하는 양 이상이라면 lysozyme과 Buffer GL/GB의 사용량을 증가시키고 세포현탁액(homogenate)를 두 개의 tube로 분리하여 진행합니다. 적절한 양의 샘플을 사용하는 것은 매우 중요하며, 불완전한 용해는 column의 막힘의 원인이 되어, DNA 정제 과정이 이루어지지 않습니다.

LB 배지에서 overnight 배양한 E. coli JM109 0.5 ㎖ (OD600 = 3 - 4)정도가 적절합니다.

TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 (Code 9763A)은 그람 음성 (gram-negative)균과 그람양성(gram-positive)균으로부터 genomic DNA를 추출할 수 있으나, 세포벽 구조가 특이하거나 분해되기 어려운 일부 그람양성균(e.g.: Bacillus thuringiensis)의 경우 DNA 추출이 어렵습니다. 이 경우, 액체질소를 이용하여 균을 분쇄 후, 매뉴얼의 그람음성(gram-negative)균의 genomic DNA 추출에 관한 방법을 따라 진행합니다.

TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit (Code 9765A) 제품의 표준 실험방법은 큰 size의 genomic DNA 추출하는 데 적합합니다. 그러나 물고기와 다른 수중동물의 대부분 genomic DNA는 포유동물 (mammals)의 genomic DNA보다 작습니다. 그러므로 용해와 균질화는 매뉴얼의 “For lysis of aquatic organism such as fish” 실험방법에 따라 수행합니다.

(1) TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit (Code 9765A) 제품의 표준 실험 방법은 큰 size의 genomic DNA 추출하는데 적합합니다. 가공된 샘플의 genomic DNA는 본 제품 실험 과정에 따를 경우 small size DNA로 분해됩니다. 따라서 균질화 (homogenization)와 용해는 매뉴얼의 “For a processed product” 실험방법에 따라야 합니다.
(2) 가공된 샘플의 DNA 함량은 낮고, 추출과정 동안 분해되기 때문에, gel 전기영동에 의해서는 검출되지 않습니다.

혈장 (plasma), 전혈 (whole blood), 세포 없는 체액 (no cell body fluids), 바이러스 감염 조직과 같은 다양한 샘플로부터 viral RNA/DNA 추출이 가능합니다.

전혈 (whole blood)을 동결하게 되면, 존재하는 적혈구 (erythrocyte)와 백혈구 (leukocyte)의 대부분이 분해됩니다. 대부분의 DNA가 백혈구 내에 존재하기 때문에, 보통 동결된 전혈에서 추출한 DNA의 양은 20 - 50% 정도 감소합니다.

· TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit (Code 9760A)
일반적으로 2 ml pUC118/JM109의 LB배양액으로부터 10 μg의 고순도의 plasmid를 추출 할 수 있습니다. Plasmid DNA의 회수율이 낮다면, 다음과 같은 사항을 확인해야 합니다.
(1) E. coli가 오래된 경우 (장기간 보관, 낮은 온도).
고체배지에 도말하여 배양 후, 새로운 콜로니를 pick-up하여 액체배지에서 재배양합니다.
(2) Plasmid의 copy 수가 너무 낮을 경우.
Low-copy plasmid를 사용할 경우, plasmid DNA의 회수율이 낮으므로 세균 배양액 양을 늘립니다.
(3) 정확하게 매뉴얼에 따라 진행합니다.
(4) Elution Buffer 또는 멸균 증류수를 60℃에서 예열하여 사용하시면 elution 효율을 높일 수 있습니다.

· TaKaRa MiniBEST DNA fragment Purification Kit (Code 9761A)
일반적으로 DNA의 회수율은 70 - 95%입니다. DNA의 회수율이 낮다면, 아래 사항을 확인하세요.
(1) Buffer WB에 첨가한 100% ethanol의 양을 확인해야 합니다 (56 ml 첨가).
(2) Ethanol은 DNA elution 효율에 영향을 줄 수 있습니다. Elution과정 전의 원심분리는 잔여 ethanol을 제거 목적으로 반드시 진행합니다.
(3) Elution Buffer 또는 멸균 증류수를 60℃에서 예열하여 사용하시면 elution 효율을 높일 수 있습니다.

· TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762A)
일반적으로 DNA의 회수율은 50 - 80%입니다. DNA의 회수율이 낮다면, 아래의 사항을 확인하세요.
(1) Agarose gel 양이 많은 경우.
하나의 column은 최대 300 mg의 gel 조각으로부터 50~80%의 DNA를 회수할 수 있습니다. Gel이 300 mg이상이라면, 여러 개의 column을 사용해서 진행해야 합니다.
(2) Buffer WB에 100% ethanol을 정확한 양으로 첨가하였는지 확인합니다.
(3) Agarose gel이 완전히 녹지 않은 경우.
완전히 녹지 않은 gel은 DNA 회수율에 영향을 미칩니다. Tube inverting을 하면 gel을 효과적으로 녹일 수 있습니다.
(4) Agarose gel 용해액 (melting solution)의 pH가 높은 경우.
용해액의 색이 노란색에서 주황색이거나, 보라색으로 변한다면 용액의 pH가 높은 상태입니다. 3 M sodium acetate (pH 5.2) 10 ml를 넣어 용해액 색이 노란색이 될 때까지 섞어줍니다.
(5) 원심분리를 상온에서 하면 spin column membrane과 DNA의 결합을 향상시킬 수 있습니다.
(6) Ethanol은 DNA elution 효율에 영향을 줄 수 있습니다. Elution과정 전의 원심분리는 잔여 ethanol을 제거 목적으로 반드시 진행합니다.
(7) Elution Buffer 또는 멸균 증류수를 60℃에서 예열한 후 사용하면 elution 효율을 높일 수 있습니다.

Elution Buffer의 양은 원하는 최종 농도에 따라 선택할 수 있습니다. 일반적으로, 30 μl 이상의 Elution Buffer를 사용해야 90% 이상의 DNA를 정제할 수 있으므로 Elution Buffer의 양은 30 μl 이상의 사용을 권장합니다. 만약 높은 농도의 DNA를 얻고자 할 경우, Elution Buffer의 양을 20 μl까지 줄일 수 있습니다. 예열한 Elution Buffer사용을 하거나 Elution buffer 첨가 후 1분 뒤에 원심분리를 하면 정제 효율을 증가시킬 수 있습니다.

각 column은 최대 20 μg, 최소 500 ng의 DNA와 결합할 수 있습니다. Kit를 사용하시기 전에 DNA 샘플의 전체적인 양을 예측하는 것이 좋습니다.

분리된 DNA용액 안에 염 (salt)이 포함된 경우입니다. 염을 제거하기 위해서 Buffer WB를 넣어준 후 5분 동안 상온에 둡니다. 또는, 분리한 DNA에 ethanol이 존재할 경우입니다. Ethanol을 증발시키기 위해 2분 동안 상온에 둔 후, column에 Elution Buffer를 넣어줍니다. DNA elution buffer로 멸균 증류수를 사용합니다.

예를 들어 pUC118 같은 high-copy plasmid의 경우 2 - 4 ml의 세균 (bacteria) 배양액에서 10 - 15 μg을 추출할 수 있습니다. 일반적으로, 2 ml의 세균 배양액을 사용하도록 권장합니다.

Low-copy plasmid의 경우, 4 ml의 세균 (bacteria) 배양액을 사용합니다. pBI121의 경우, 4 ml의 세균 배양액에서 2 - 3 μg의 고순도 plasmid DNA를 추출할 수 있습니다.

과도한 샘플양으로, Bacteria의 용해가 완전히 이루어지지 않았기 때문입니다. Bacteria 배양액의 양은 경우에 따라 1 - 4 ml을 사용합니다.

Solution l 첨가 후, bacteria가 완전히 섞이지 않았기 때문입니다. Bacteria는 vortexing을 통해 완전히 섞어주어, Solution ll를 첨가하기 전에 덩어리가 없어야 합니다.

(1) 사용한 template DNA의 양이 정확하지 않은 경우입니다. Plasmid DNA의 정량 분석을 수행합니다. Plasmid DNA 정량을 위해, 흡광도를 측정할 때, DNA 용액내의 불순물은 흡광도 측정에 영향을 줍니다. 그러므로 plasmid DNA 정량 분석을 위해서 agarose gel 전기영동을 추천합니다.

(2) Plasmid DNA의 순도 (purity)가 좋지 않은 경우입니다. 매뉴얼에 따라 신선한 bacteria 배양액에서 바로 추출한 샘플을 사용합니다. DNA elution buffer로 멸균 증류수를 사용합니다.

(3) Insert DNA의 서열이 복잡한 경우입니다. 일부 DNA는 복잡한 서열 (GC rich, 반복서열)을 가지고 있어, sequencing이 어려우므로 보다 향상된 sequencing 방법을 사용하여 진행합니다

Solution ll를 넣어준 후에는 cell lysate를 약하게 섞어주어야 합니다 (Vortex 하지 않습니다). 또한, Solution lll를 넣어준 후 5분 이상 용해 (lysis) 반응을 하지 않습니다. Bacteria는 16시간 이상 배양하지 않는 것을 권장합니다. 일반적으로 Bacteria 배양시간은 12 - 16시간이 적절합니다.

Solution I에 RNase A를 넣었는지 확인합니다. Solution I에 RNase A를 첨가한 이후에는 Solution I을 4℃에서 보관합니다. Solution I에 RNase A를 넣어준 후 3개월 이상 보관하면 RNase A의 활성이 감소하기 때문에, 다시 RNaes A를 첨가합니다.

DNA 단편의 길이가 길다면 (10 kb이상), DNA의 회수율이 낮으므로, 아래의 방법으로 진행합니다.
(1) 샘플량을 2 - 5 μg으로 증가시킵니다. Elution Buffer를 사용시, 65℃로 예열하면 elution 효율을 향상시킬 수 있습니다.
(2) DNA의 물리적인 손상의 원인이 될 수 있는 vortexing같은 과정은 피합니다. 또한, DNA를 장시간 동안 자외선에 노출되면, DNA에 손상이 생기므로 반복적인 자외선 노출을 피하도록 합니다.
(3) 효율적인 Agarose gel에서 DNA의 추출을 위해 b-Agarose를 사용하는 것도 좋습니다.

(1) 샘플이 불완전하게 용해 (lysis) 된 경우입니다. 샘플을 액체질소가 있는 상태에서 막자와 막자사발을 이용하여 잘게 분쇄합니다(매뉴얼의 조직이나 세포의 용해 및 균질화 (homogenization)에 대한 방법을 참고).
(2) 샘플 양이 많은 경우입니다. 많은 양의 샘플은 핵산을 대량으로 포함하고 있어 column을 막히게 합니다 (샘플과 Buffer RL의 양에 대한 자세한 사항은 9767A 제품 매뉴얼의 “VI. sample amount and Buffer RL volume”을 참고).
(3) 부적절한 온도에서 원심분리한 경우입니다. 원심분리 할 때, 너무 낮거나 높은 온도는 RNA Spin Column에 영향을 주어 막히게 할 수 있습니다 (적정온도 20~25℃).

(1) RNA를 추출하려는 샘플이 용해가 충분히 되지 않았거나, 혹은 균질화 (homogenization)가 제대로 되지 않았을 경우입니다. 효율적인 RNA추출을 위해서는 샘플을 완전히 용해시킵니다 (매뉴얼에서 “조직이나 세포의 용해 및 균질화 방법”에 관한 자세한 사항을 참고).
(2) 샘플의 양이 많은 경우입니다. TaKaRa MiniBEST Universal RNA extraction kit (Code 9767A) 사용시, 샘플의 양과 Buffer RL의 양에 관한 사항은 매뉴얼의 “VI. sample amount and Buffer RL volume”에 자세히 나와있습니다. TaKaRa MiniBEST Plant RNA extraction kit (Code 9769A) 사용시, 일반 식물 조직에서 적정 초기 샘플의 양은 50 ? 100 mg이며, 다당류와 polyphenol이 많은 식물조직은 20 ? 50 mg을 이용할 것을 권장합니다.
(3) RNA가 완전히 elution되지 않은 경우입니다. RNA를 elution step을 반복합니다. RNA가 남아있는 Spin Column에 RNase-Free dH2O를 넣고 10분 후 elution을 진행합니다.
(4) Elution 용액에 잔여 ethanol이 존재한 경우입니다. Buffer RWB를 이용하여 washing시, Spin Column membrane에서 ethanol을 완벽히 제거하기 위해 12,000 rpm에서 1분 원심분리를 합니다. 매뉴얼을 참고하세요. (잔여 ethanol은 RNA 정제율 저하 원인)

(1) 오래된 샘플을 이용한 경우입니다. 가능하면, RNA를 추출할 샘플을 바로 사용하거나 액체질소를 이용하여 보관합니다 (-80℃ 보관).
(2) RNase가 시약과 실험도구에 존재할 경우입니다. 실험을 시작하기 전, 매뉴얼의 “IV. Precautions for Preventing RNase Contamination”을 참고하여 진행할 것을 권장합니다.
(3) 샘플에 RNase가 많이 존재하는 경우입니다. 되도록 적은 양의 샘플을 사용하고 RNase가 많이 있는 조직과 세포를 사용할 시, Buffer BL의 양을 증가시킵니다.

gDNA Eraser Spin Column을 사용하여 샘플에 존재하는 genomic DNA를 효과적으로 제거할 수 있습니다. 일반적으로 정제된 RNA는 genomic DNA가 포함되어 있지 않으나, genomic DNA가 포함되어 있다면, 이유는 다음과 같습니다.
(1) 불충분한 용해 (lysis)와 비균질화 (homogenization)경우입니다. 완전히 용해 되지 않으면 genomic DNA가 남게 되므로, 완벽한 샘플용해가 필요합니다(매뉴얼에서 조직이나 세포의 용해 및 균질화 방법에 대한 자세한 사항을 참고).
(2) 샘플 양이 많은 경우입니다. 많은 양의 샘플은 gDNA Eraser Spin Column에서 정제 가능한 용량을 초과하는 핵산을 포함하며, 그 결과 genomic DNA가 잔존하게 됩니다 (샘플의 양과 Buffer RL의 양에 관한 자세한 사항은 “VI. sample amount and Buffer RL volume”을 참고).
(3) 샘플 내 genomic DNA가 많이 존재하는 경우입니다. Genomic DNA는 조직마다 존재하는 양이 다르며, genomic DNA가 많이 포함된 경우, 샘플 양을 줄이고, Buffer BL/Buffer PE나 DNase I의 양을 증가시킵니다.

260 nm (A260), 320 nm (A320) 그리고 280 nm (A280)에서의 흡광도는 각각 핵산, 시약의 탁도 (turbidity), 염 (salt)과 단백질 농도를 나타냅니다. OD260/280(R)값은 단백질과 같은 유기체의 오염 정도를 나타내며, 고품질의 RNA는 1.8과 2.2사이입니다. 비율이 1.8보다 낮다면, 단백질이 오염된 것을 의미하며, 2.2보다 높으면 RNA가 mononucleotide로 분해된 것을 의미합니다. RNA 흡광도 값을 측정 시 TE buffer를 사용하여 RNA을 희석하여 확인합니다.

파장마다 측정되는 RNA의 흡광도에 따라 RNA의 농도를 아래 공식으로 계산합니다.
RNA (μg/μl)=(OD260-OD320)X dilution X 0.04 μg/μl

200 bases이상의 RNA를 효과적으로 정제 할 수 있습니다. 만약, TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (9769A)를 사용하여 small RNA를 추출하고자 하는 경우, 매뉴얼의 Appendix를 참고하세요.

Genomic DNA는 옵션 protocol로 추출 가능하며, 추출 양은 일반 genomic DNA 추출 제품을 사용했을 때보다 낮습니다. 추출한 genomic DNA는 PCR template로만 사용 가능합니다. Genomic DNA가 적은 샘플을 이용하거나, 고순도의 genomic DNA를 추출하고자 한다면 genomic DNA 전용 추출 제품, TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit (Code 9765A)를 권장합니다.

아래 표를 참고하여 최적의 실험방법을 선택합니다. 샘플이 Table 1에 없다면, Protocol-I에 따라서 RNA를 추출합니다. 만약 RNA 정제율이 낮다면, Protocol-II에 따라서 RNA를 추출합니다.