4세대 Lentivirus packaging 시스템인 Lenti-X™ Expression System (Code 632164 외)은 높은 수율, 편리한 사용, 안전성을 위해 시스템을 최적화되었다. 이 제품은 타겟하는 tropism에 따라 다양한 pseudotype (envelope 단백질)을 선택할 수 있도록 아래와 같이 준비되어 있다.

• VSVG envelope - VSVG pseudotype의 lentivirus는 사실상 대부분의 cell type에 감염이 가능하다. 또한 실험 목적에 따라 integration이 일어나지 않는 Integrase Deficient 제품도 선택이 가능하다.
• Ecotropic envelope - MLV ecotropic envelope glycoprotein을 가지는 pseudotype lentivirus는 mouse와 rat에만 transduction이 가능하다.
• Envelope Free - 원하는 envelope 유전자를 empty vector에 직접 cloning하여 해당 envelope을 가진 pseudotype lentivirus를 생산할 수 있다. 이는 감염병 연구에서 중화실험 (neutralization assay) 목적으로도 사용이 가능하다.

4세대 Lentivirus packaging 시스템에 대한 내용은 아래의 동영상에서 확인할 수 있다.


■ 특징 1. 고역가의 Lentivirus 생산
당사의 Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외) 을 사용하는 4세대 lentivirus packaging 시스템은 시중에 판매되는 다른 lentivirus 시스템에 비해 월등히 높은 역가의 lentivirus 생산이 가능하다 (10⁷~10⁸ IFU/㎖, 시중에 판매되는 일반적인 제품의 25배 이상).

How are such high titers achieved?

• 최적화된 조성 - 4세대 lentivirus 시스템에 다섯가지 packaging plasmid (그림 1)와 transfection 시약의 비율이 생산 효율을 극대화할 수 있도록 최적화된 premix 형태로 제공된다.
• Tetracycline transactivation - 4세대 lentivirus 시스템은 Tet-system promoter를 사용해 packaging plasmid의 유전자를 높게 발현한다.
• 최적화된 transfection 시약 - premix에 포함된 Xfect™ transfection Reagent는 HEK 293T cell에서 일관되게 95% 이상의 효율을 보여 packaging plasmid의 유전자를 높게 발현한다.
• 최적화된 Lenti-X™ 293T cell line - 본 시스템과 함께 사용할 경우 가장 높은 역가의 lentivirus 생산이 가능하도록 선별된 packaging cell로 10⁸ IFU/㎖의 lentivirus를 생산할 수 있다.

그림 1. 4세대 lentivirus 시스템에 5가지 packaging plasmid (오른쪽). 4 세대 lentivirus 시스템은 Tet-Off와 Tat transactivator에 의해 바이러스를 구성하는 필수적인 단백질을 높게 발현한다. 여기서 pol 유전자가 vpr 유전자와 융합되어 reverse transcriptase와 integrase가 바이러스 안에 같이 packaging되게 한다. 또한 이 시스템은 gag 및 pol 유전자를 다른 plasmid로 분리해서 안전성을 향상시켰다.

How much packaged lentivirus can be obtained from a single Lenti-X packaging reaction?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)을 사용하면 10⁷~10⁸ IFU/㎖으로 시중에 다른 lentivirus 시스템의 역가를 월등히 뛰어넘는 고역가로 lentivirus 상등액 10 ㎖을 생산할 수 있다 (그림 2).

그림 2. Lenti-X™ 시리즈 (패널 A)와 타사 packaging 시스템 (패널 B)을 사용해 Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180)에서 ZsGreen1을 발현하는 lentivirus를 생산. 생산된 lentivirus 배양 상등액을 HeLa cell에 transduction하였다. 그 결과 Lenti-X™ 시리즈로 생산된 상등액 10 ㎕은 대부분 cell 내로 도입되었고, 다른 제품으로 생산된 상등액 10 ㎕은 극히 일부의 cell 내로만 도입되었다.

Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)의 최대 역가는 pLVX backbone에서 ZsGreen1을 발현해 flow cytometry로 측정한 결과 5 x 10⁸ IFU/㎖ (농축하지 않은 경우)이었다. pLVX 벡터는 cPPT/CTS, RRE, WPRE, wild-type 5' LTR 서열을 가지고 있어 고역가 lentivirus 생산이 가능하다. 13번의 실험에 걸쳐 10종의 형광 단백질을 사용해 테스트한 결과 Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)과 pLVX 벡터를 사용한 경우, 평균 1.85 x 10⁸ IFU/㎖ 역가를 생산할 수 있었다 (HeLa cell에 transduction 하여 flow cytometry로 측정한 결과).

■ 특징 2. 안전성 강화
Lentivirus 시스템은 안전성을 위해 복제 능력을 가진 바이러스 (replication-competent lentivirus; RCL)가 최대한 발생하지 않도록 기술이 개발되었다. RCL은 packaging plasmid의 유전자 (gag-pro, env, pol 등)가 recombination을 통해 expression vector에 삽입되는 경우 생성된다. 4세대 lentivirus 시스템은 gag-pro 유전자와 pol 유전자가 별도의 두 개의 plasmid에 있기 때문에 (그림 1) 세 번의 recombination이 발생해야 RCL이 생성될 수 있다. 따라서 4세대 lentivirus는 plasmid의 recombination으로 인한 RCL이 발생할 가능성이 낮기 때문에 더욱 안전성이 높다.

■ Lentivirus packaging FAQ

Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275)을 사용하면 매우 간단한 프로토콜로 고역가의 VSV-G의 pseudotype lentivirus 생산이 가능하다. 이 제품의 tube에는 Xfect™ transfection Reagent와 packaging plasmid가 최적의 조성으로 premix되어 동결건조 형태로 제공되어 lentivirus expression vector와 물만 넣어서 10 cm dish의 293T cell에 넣어주면 고역가 lentivirus를 간단하게 생산할 수 있다.

그림 3. Lenti-X™ Packaging Single Shots workflow
당사는 VSV-G pseudotype lentivirus 이외에도 ecotropic pseudotype lentivirus를 생산하기 위한 packaging 시스템을 판매하고 있다.

Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)의 간단한 실험을 아래의 동영상에서 확인하실 수 있습니다.

• Lenti-X™ Packaging Single Shot 실험 동영상 보러가기

What type of cells should be used for packaging?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)은 Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180)와 같이 사용하기에 최적화되어 있다. 이 cell은 Takara에서 높은 역가의 lentivirus를 생산할 수 있도록 선별된 clone이다. HEK293이나 293FT 같은 cell도 사용할 수 있으나 Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180) 대비 더 낮은 역가의 lentivirus가 생산될 수 있다.

그림 4. Lenti-X™ 293T Cell Line을 사용한 경우 293FT 대비 6배, HEK293 대비 30배 이상의 고역가로 lentivirus를 생산할 수 있다.

How consistent are results?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)은 실험 과정에서 생길 수 있는 변수를 최소화하여 일관된 transfection 효율로 높은 역가의 lentivirus 생산이 가능하다.


그림 5. 일관된 고효율 transfection으로 고역가 lentivirus 생산이 가능하다.
ZsGreen 1을 발현시키는 lentivirus를 Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)으로 네 번에 걸쳐 생산하였다. Transfection 후 48시간이 지난 다음 packaging cell을 형광현미경과 일반 현미경으로 관찰하였고 (패널 A), 이후 lentivirus가 있는 상등액을 회수해서 HT1080 cell에 transduction하여 역가를 측정하였다 (패널 B).

Which types of lentiviral vectors are compatible with this system?
Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)은 expression vector의 backbone이나 사용된 titration 방법의 종류와 관계없이 높은 역가의 바이러스를 생산할 수 있다.


그림 6. Expression vector의 backbone에 관계없이 높은 역가의 lentivirus 생산이 가능하다.
CMV ZsGreen1 유전자를 각각의 expression vector에 cloning하고 이 vector를 Lenti-X™ Packaging Single Shots으로 packaging하여 lentivirus를 생산하였다. Transfection 후 48시간 뒤 역가를 다양한 방법으로 측정하였고 (qRT-PCR, Lenti-X qRT-PCR Titration Kit / p24 ELISA, Lenti-X p24 Rapid Titer Kit / 간이 역가측정, Lenti-X™ GoStix™), 실제 감염성을 테스트하기 위해 바이러스 상등액을 HT1080 cell에 transduction 후 flow cytometry로 측정하였다.

이론적으로 HIV-1 기반의 lentivirus expression vector는 Lenti-X™ Packaging Single Shots (Code 631275 외)으로 매우 효과적이게 packaging 될 수 있다. 예를들어 ZsGreen1을 pLenti6/V5 vector (Thermo Fisher Scientific)에 cloning한 경우 이 vector는 WPRE 와 cPPT/CTS 서열이 없이ㄸ self-inactivating (SIN) LTR을 사용해 약 3 x 10⁷ IFU/ml 정도의 역가가 나온다 (flow cytometry 측정 결과). 반면, Lenti-X™ 시스템은 HIV-1 유래의 5’LTR에 있는 tat transactivation과 WPRE 와 cPPT/CTS 서열을 사용해 다른 방법보다 더욱 높은 역가의 lentivirus를 생산할 수 있다 (예, pLVX vector 시리즈).

What is the cloning/packaging capacity of an HIV-1-based lentiviral vector?
Wild type lentivirus는 양끝 LTR 서열 사이로 ~9.7kb의 genome을 가지고 있다. 인공적으로 만든 lentivirus가 이보다 큰 genome을 가지는 경우 바이러스가 불안정해지고 역가 역시 급격하게 감소한다. Lenti-X™ 시스템과 같은 제품으로 생산된 재조합 lentivirus는 바이러스 genome의 많은 부분이 selection marker나 형광 단백질과 같은 유용한 서열로 대체되었지만 transgene을 cloning하기에 충분한 공간이 남아있다.

• pLVX-Puro vector의 경우 3’ LTR까지 약 5.4 kb의 서열이 있다. 따라서 최대 약 4.3 kb의 서열을 transgene으로 cloning할 수 있다.
• pLVX-IRES-tdTomato의 경우 3’ LTR까지 약 6.3 kb의 서열이 있다. 따라서 최대 약 3.4 kb의 서열을 transgene으로 cloning할 수 있다.

■ 추천하는 Lentivirus packaging 시스템

	제품명	특징
연구목적	Lenti-X™ Packaging Single Shots	매우 간편한 4세대 lentivirus packaging 시스템. 1step 방법으로 고역가 (107~108) lentivirus 생산 가능. - Transfection 시약 포함 동결건조 premix
임상목적	LVpro Packaging Mix	Tat-independent한 3세대 lentivirus packaging 시스템 HIV-1 유래 서열을 최소화해 안전성 극대화 - 별도의 transfection 시약 필요, VirusGEN® LV Transfection Kit (Code MIR 6760) 추천
Packaging cell	Lenti-X™ 293T Cell Line	고역가 lentivirus 생산을 위해 최적화된 293T 클론