AAV delivery FAQ
■ 일반적인 질문
Q1. AAV는 무엇인가요?
Adeno-associated virus (AAV)는
Dependovirus 속, Parvovirus 계열에 속하는 비외피 바이러스 (nonenveloped virus)입니다. AAV는 사람에게 병원성을 갖지 않는다고 알려져 있으며, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 (herpesvirus)와 같은 helper virus가 있는 경우에만 복제가 가능합니다. 캡시드 구조 단백질은 바이러스가 조직/세포를 감염시키는 능력을 결정하며, 조직 특이성은 다양한 serotype에 따라 달라지는 것으로 알려져 있습니다.
Q2. AAV는 어떤 특징 때문에 유전자 전달을 위한 벡터로 사용되나요?
유전자를 세포 및 유기체에 전달하기 위해 AAV의 특성을 이용합니다. AAV 벡터는 일반적으로 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터보다 안전하다고 알려져 있습니다. AAV 벡터는 유전자를 증식 세포 (proliferating cells)와 비증식 세포 (nonproliferating cells) 모두에 transduction하는데 사용될 수 있으며, 비분할 세포 (nondividing cells)에서 장기간 발현할 수 있습니다. 또한 AAV는 면역원성이 거의 없어 동물 개체에 유전자를 도입하는데 적합합니다 (
in invo transduction 도구로 활용).
Q3. 다양한 AAV의 다양한 serotypes의 각 특징은 무엇인가요?
Serotype은 캡시드 구조 단백질의 유형에 따라 분류되며 조직 특이성을 결정합니다. Serotypes 2 (AAV2)가 가장 많이 연구된 혈청형으로 AAV2는 광범위한 조직 감염성을 가지며 연구 목적으로 가장 널리 사용됩니다. Serotype 5 (AAV5)와 serotype 6 (AAV6)은 조금 더 특이적인 조직 감염성을 갖고 있습니다; AAV5는 중추신경계, 간, 망막을 포함한 조직의 세포를 감염시킬 수 있고, AAV6는 심장, 근육, 간을 포함한 조직의 세포를 감염시킬 수 있습니다.
다카라바이오는 현재 유전자 전달을 위한 AAV의 생산, 정제 및 역가 측정을 위한 제품을 제공하고 있습니다.
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Q4. 재조합 AAV를 사용할 때 주의사항이 있나요?
AAV 벡터를 실험실에서 사용할 때는 잠재적인 위험성을 이해하고 충분한 예방조치가 필요합니다.
바이러스는 삽입된 유전자에 따라 잠재적인 위험성을 갖고 있습니다. 유사한 벡터가 human 유전자 치료를 위해 승인을 받았으며, 이는 생체 내에서 유전자를 발현할 수 있다는 잠재적인 능력을 입증한 것입니다. 따라서 재조합 바이러스의 생산 및 취급 시 적절한 주의를 기울여야 합니다.
재조합 DNA와 관련된 연구에 적용 가능한 모든 지침을 따라야 합니다.
생물학적으로 안전한 캐비넷에서 작업하고, 실험실 코트와 얼굴 보호구 및 장갑을 착용하는 등 재조합 AAV를 생산하거나 취급할 때 적절한 안전 조치를 취하십시오.
Q5. in vivo 유전자 전달에 AAV를 사용한 논문이 있나요?
AAVpro
® 시리즈를 사용하여 생성된 AAV2 입자는
in vivo에서 마우스의 특정 뇌에 있는 세포에 형광 마커 유전자를 전달하는데 사용되었습니다.
>> 데이터 보기
추가로 AAV는 아래 연구들에서 유전자를 전달하는데 사용되었습니다 (아래 예들은 AAVpro 제품을 사용하지는 않았습니다).
타겟 조직 |
설명 |
Citation |
Brain |
Cre유전자를 뇌실하 (subventricular) 구역으로 전달하는데 AAV를 사용함 |
Lee N., et al. Ciliary neurotrophic factor receptor regulation of adult forebrain neurogenesis. J. Neurosci. 33, 1241-1258 (2013). |
Brain |
AAV2를 이용하여 해마 (hippocampus)에 유전자를 전달함 |
Passini MA, et al. AAV vector-mediated correction of brain pathology in a mouse model of Niemann-Pick A disease. Mol. Ther. 11, 754-762 (2005). |
Liver |
간 특이적 프로모터 조절 하에 있는 유전자를 전달하는 AAV2를 마우스 정맥내에 투여함 |
Ziegler RJ, et al. AAV2 Vector Harboring a Liver-Restricted Promoter Facilitates Sustained Expression of Therapeutic Levels of a-Galactosidase A and the Induction of Immune Tolerance in Fabry Mice. Mol. Ther.9, 231-240 (2004). |
Pancreas |
AAV2를 이용하여 마우스 췌장에 유전자를 전달함 |
Wang AY, et al. Comparison of adenoviral and adeno-associated viral vectors for pancreatic gene delivery in vivo. Hum Gene Ther. 15, 405-413 (2004). |
Q6. 일반 동물 실험에 AAV를 얼마나 사용하나요?
사용되는 양은 타겟 조직 및 투여 방법에 따라 다르지만, 마우스의 경우 10
11-10
12 vg/1마리 (vg = vector genome, Real-Time PCR으로 측정함)가 사용됩니다. 하지만 적절한 dose는 시험 (테스트)을 통해 결정되어야 합니다.
■ 재조합 AAV 생산 관련 질문
Q1. ‘helper-free’ 생산이 무엇인가요?
일반적으로 AAV 복제는 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 (herpesvirus)와 같은 helper virus가 필요합니다. 하지만 다카라바이오의 AAV helper-free 벡터 시스템은 재조합 AAV를 생산할 때 helper virus가 필요하지 않습니다. 대신, 재조합 AAV 입자를 만드는데 필요한 요소를 인코딩하는 플라스미드를 HEK 293 cells (예:
AAVpro® 293T Cell Line)에 co-transfection하여 AAV를 생산합니다.
그림1. Helper-free 생산 시스템
Q2. AAV 생산에 적합한 세포는 무엇인가요?
AAVpro
® Helper Free 시스템의 경우 HEK 293T 또는 HEK 293 cells을 사용할 수 있습니다.
여러 HEK 293 및 HEK 293T cell lines이 시판되고 있습니다. 바이러스 생산은 cell line의 특징에 크게 의존하기 때문에 고역가의 AAV 생산을 위해서는
AAVpro® 293T Cell Line (Code 632273)* 또는 HEK 293T/17 cells (ATCC, CRL-11268)을 추천합니다.
*AAVpro® 293T Cell Line (Code 632273)은 transformation된 HEK 293 (human embryonic kidney cell line HEK 293)의 클론으로, transfection이 매우 잘되고 높은 수준의 바이러스 단백질을 발현합니다. 또한 이 cell line은 simian virus 40 (SV40) large T antigen을 발현합니다. 따라서 AAVpro Helper Free System과 함께 사용하면 높은 역가의 재조합 AAV를 생산할 수 있습니다.
Q3. 배양된 세포의 감염을 확인할 수 없는데, 이유는 무엇인가요?
높은 역가의 AAV가 생성되지 않았을 가능성이 있습니다. 다음 사항들이 원인이 될 수 있습니다.
1. 사용된 HEK 293 cell line에 따라 AAV 생산에 영향을 미칠 수 있습니다. 효율적인 AAV 생산이 확인된
AAVpro® 293T Cell Line (Code 632273) 또는 HEK 293T/17 (ATCC CRL 11268) cells를 사용하는 것을 추천합니다.
2. Transfection 효율이 낮을 가능성이 있습니다. Transfection시,
TransIT-VirusGEN® Transfection Reagent (Code MIR 6700 외)를 사용하면 높은 감염활성을 가지는 고품질의 AAV를 생산할 수 있습니다.
Q4. Control vector를 제공하나요?
네,
LacZ 또는
ZsGreen1을 발현하는 AAV 벡터가 있습니다.
Q5. 다른 회사의 AAV 생산 키트와 비교하여 AAVpro Helper Free System의 장점은 무엇인가요?
당사의 제품 (AAV2 시스템 한정)에는 AAV 생산을 증가시키는 human microRNA인 hsa-miR342를 발현하는 벡터가 포함되어 있습니다. 이 시스템은 pRC2 벡터를 단독으로 사용할 때에 비해 역가를 ~2배 증가시킵니다.
AAVpro Helper Free System (AAV2)으로 생산한 AAV 입자의 양은 10
10 및 10
11 vg/10 cm dish 정도입니다 (vg = vector genome, real-time PCR로 측정). 생산된 AAV 입자의 양은 배양 조건과 타겟 유전자에 따라 달라집니다.
■ AAV 정제 질문
Q1. AAV 벡터를 정제하고 싶습니다. 어떤 키트를 추천하나요?
모든 AAV serotype에 적용할 수 있는
AAVpro® Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666 외)을 추천합니다.
>> 기술 노트 보기
Q2. AAVpro Purification Kit (All Serotypes)를 사용하면 어떤 이점이 있나요?
AAV 정제에 일반적으로 초원심분리 (ultracentrifugation)를 사용하지만 이 방법은 숙련된 기술이 필요한 것은 물론, 2~3일 정도의 긴 시간이 걸립니다. AAVpro Purification Kit (All Serotypes)는 바이러스 생산 세포로부터 모든 serotype 정제까지 간단하고 빠른 (~4시간) 방법을 제공합니다.
AAVpro
® Purification Kit Maxi (All Serotypes)를 사용한 AAV 입자 정제 프로토콜 요약
정제된 AAV는
in vivo 연구에 사용될 수 있습니다.
>> 비디오 프로토콜 보기
Q3. AAVpro® Purification Kit (All Serotypes)를 사용하여 AAV 정제에 사용할 수 있는 세포 수는 몇 개인가요?
AAVpro® Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666 외)를 사용하면 최대 5개의 T225 세포 배양 플라스크에서 배양한 세포로부터 AAV 입자를 정제할 수 있습니다. 자세한 내용은 아래 표를 참고하세요.
Q4. 동물에게 투여하려면 AAV 입자를 어떻게 정제해야 하나요?
In vivo transduction에 대한 정해진 purity 기준은 없습니다만, SDS-PAGE 분석을 통해 AAV purity를 확인할 수 있으며, 세 개의 주요 밴드 (AAV VP1, VP2, VP3에 해당)만 나타나야 합니다.
AAVpro® Purification Kit (All Serotypes) (Code 6666 외)를 사용하여 정제된 AAV 입자는 여러 동물 종의
In vivo transduction이 성공적으로 수행되었습니다.
>> 기술 노트 보기
AAVpro® Purification Kit Maxi (All Serotypes) (Code 6666)를 사용하여 5개의 T225 플라스크에서 배양한 producer cell로부터 형광 단백질 ZsGreen1을 보유하는 serotype AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6의 바이러스를 정제했습니다. 레인당 1X109 벡터 게놈을 로딩하여 각 샘플을 SDS-PAGE 했을 때, 각 serotype 샘플에는 AAV VP1, VP2, VP3에 해당하는 3개의 밴드를 확인할 수 있었습니다.
Q5. AAVpro® Purification Kit (All Serotypes) (Code 6675외)를 사용한 AAV 입자의 표준 수율은 얼마인가요?
vg = viral genome
■ AAV titration 질문
Q1. AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) (Code 6233)로 어떤 serotype을 측정할 수 있나요?
본 제품의 프라이머는 AAV2의 ITR (inverted terminal repeat) 영역에 특이적입니다. 따라서 사용되는 AAV 벡터에 AAV2의 ITR 영역이 이다면 serotype에 관계없이 역가측정이 가능합니다.
Q2. 다른 기존 역가측정 방법과 비교하여 AAVpro kit의 장점은 무엇인가요?
일반적으로 삽입된 서열의 영역은 AAV 벡터를 정량할 때 많이 사용됩니다. 하지만 이 방법을 이용하려면 각 AAV 벡터에 대한 프라이머를 매번 디자인해야 합니다. AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR)는 벡터의 공통 서열인 AAV2 inverted terminal repeat (ITR)을 타겟하기 때문에 벡터의 ITR 서열이 AAV2에서 파생된 경우 (가장 일반적으로 사용되는 구성)라면 하나의 키트로 serotype 관계없이 사용할 수 있습니다.
■ AAV 추출 질문
Q1. AAVpro® Extraction Solution (Code 6235)은 모든 AAV serotype 에 사용할 수 있나요?
Serotype 상관없이 사용할 수 있습니다. 그러나 일부 serotype의 경우 기존 방법에 비해 추출 효율이 낮을 수 있습니다. AAV5의 경우 AAVpro
® Extraction Solution을 사용했을 때, freeze-thaw에 비해 추출 효율은 낮았지만 오염 물질이 더 적었습니다.
>> AAVpro® Extraction Solution에 대해 더 자세히 알아보기
Q2. AAV Extraction Solution B를 첨가하자 용액이 분홍색으로 변했습니다. 문제가 될 수 있나요?
시료에 따라 AAV Extraction Solution B 첨가 시 용액이 분홍색으로 변할 수 있으나, 추출 효율에 영향을 미치지 않습니다.
