IVT (in vitro transcription) 실험에는 template DNA 준비부터 최고수율의 IVT까지, 간단하게 진행하는 Takara IVTpro™시리즈를 추천합니다. 아래 내용은 실험 과정에서 생길 수 있는 질문들에 대한 FAQ입니다.

DNA template preparation (Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141))
Q1. Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)에 포함된 Cloning Kit for mRNA Template은 별도로 구매할 수 있나요?
mRNA 합성을 위한 template plasmid 제작 Kit인 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143) 는 별도로 구매하실 수 있습니다.

Q2. Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)으로 template plasmid를 제작하려면 어떤 것이 필요한가요?
in vitro transcription을 위한 template plasmid는 target coding sequence (CDS or GOI; gene of interest)만 준비하면 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)을 사용하여 제작할 수 있습니다. 이 제품에 포함된 linearized template vector는 아래의 서열들을 포함하고 있습니다.

• T7 promoter sequence
• Transcription start sequence (AGG); CleanCap^® AG 등의 cap analog에 적용 가능
• 5’-UTR; Kozak sequence
• 3’-UTR; Poly(A)105
• Multiple restriction enzyme site (eg. Hind III)

Linearized template vector의 전체 sequence data는 제품페이지의 “※서열 정보”에서 확인하실 수 있습니다. 이 vector에는 stop codon이 포함되어 있으나 target sequence에도 stop codon을 추가해 stop codon read-through를 방지하는 것을 권장합니다.

Q3. Target coding sequence의 cloning 이후 vector의 linearization은 어떻게 진행하나요?
Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)를 사용할 경우, Poly (A) sequence 바로 다음에 Hind III 인식서열을 제한효소로 자르는 것을 권장합니다 (Hind III (Code 1060A)). 이외 직접 DNA template을 디자인하는 경우 제한효소의 인식서열 밖을 자르는 (type IIS 제한효소) BspQ I (Code 1227A)을 사용해 Poly (A) sequence 다음에 extra sequence가 없도록 하는 것을 추천합니다.

주의. Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)에서 GOI 혹은 GOI와 template vector의 접합부에 Hind III 제한효소 인식서열이 있는 경우 아미노산 서열이 바뀌지 않도록 codon을 변경하여 이를 제거해야 합니다. 다른 제한효소도 사용 가능하나 Poly(A) tail 다음에 extra sequence가 생겨 mRNA의 translation에 영향을 준다고 알려져 있기 때문에 추천하지 않습니다.

Q4. Vector의 linearization시 효율적인 IVT를 진행하려면 어떤 말단 구조의 DNA를 제작해야 하나요?
제한효소 반응 후 3’-protuding 말단의 경우 생산된 RNA 말단에 의도치 않은 서열이 추가하기 때문에 5’-overhang 또는 blunt의 말단을 가지는 것을 추천합니다. Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)로 제작된 template plasmid에 Hind III (Code 1060A)를 적용하는 경우 3 bp의 5’-overhang의 말단구조를 가지게 됩니다.

Q5. Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)에 linearized template vector는 어떤 cap analog를 사용할 수 있나요?
Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)에 linearized template vector는 AGG의 transcription start site를 가지고 있기 때문에 CleanCap^® Reagent AG (TriLink BioTechnologies, No. N-7113 or N-7413)를 가장 추천합니다. 이외 ARCA나 conventional m7G cap analog를 사용하는 경우 transcription start site (+1)의 nucleotide를 G로 변경해야 합니다 (AGG -> GGG). 이에 대한 자세한 내용은 Co-transcriptional capping tech note 또는 사용자 매뉴얼을 참고 부탁드립니다.

Q6. Target coding sequence (GOI)의 size는 얼마까지 적용 가능한가요?
당사에서는 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)를 사용해서 12 kb의 GOI까지 테스트되었습니다. 다만 mRNA의 수율 및 quality는 4 kb이상의 GOI에서 저하될 수 있습니다. 당사에서는 FLuc mRNA (약 1.9 kb)를 사용해서 고품질, 고수율의 mRNA 합성 결과를 확인했습니다.

in vitro transcription for RNA synthesis (Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144))
Q1. Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)과 Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144) 두 제품은 어떻게 다른가요?
Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141)에는 mRNA 합성을 위한 template plasmid 제작 Kit인 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)이 포함되어 있습니다. 이미 mRNA 합성을 위한 DNA template을 가지고 있다면 Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)을 사용할 수 있습니다.

Q2. Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)에는 어떤 DNA template을 적용할 수 있나요?
이 제품에는 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)으로 제작한 template plasmid를 linearization한 DNA 혹은 T7 promoter 서열을 가진 DNA template (e.g. PCR amplicon 혹은 fully synthesized DNA fragment)을 사용할 수 있습니다.

Q3. mRNA는 5’-cap과 3’의 poly(A) 구조를 꼭 가져야만 translation이 되나요?
5’과 3’의 말단구조는 mRNA가 세포에서 translation되고 안정하게 남아있기 위해 매우 중요합니다. 이런 말단구조가 누락되면 translation과 단백질의 발현도가 현저히 감소합니다. 따라서 이러한 말단구조를 추가하기 위한 서열들이 이미 포함된 Cloning Kit for mRNA Template (Code 6143)의 linearized template vector를 사용하는 것을 강력하게 추천합니다 (transcription start sequence (CleanCap^®AG용), UTR, poly(A) sequence 등).

Q4. Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141) 또는 Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)를 사용하면 한번에 어느 정도의 mRNA를 합성할 수 있나요?
FLuc mRNA (약 1.9 kb) 기준 200 ㎍ (20 ㎕ 반응액)의 RNA를 합성할 수 있습니다. 당사 테스트 결과, 이 RNA 합성 수율은 10배까지의 스케일업 (200 ㎕ 반응액)에서도 일정했습니다.

Q5. Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)에 10X Enzyme Mix는 어떤 enzyme을 기반으로 제작되었나요?
10X Enzyme Mix는 T7 RNA Polymerase ver.2.0 (Code 2541A)을 기반의 mixture입니다. 따라서 in vitro transcription을 진행하기 위해서는 DNA template에 T7 promoter sequence가 있어야 합니다.

Q6. 이외 추가적으로 구매가 필요한 제품이 있을까요?
mRNA에 cap structure가 필요한 경우 CleanCap^® Reagent AG (TriLink BioTechnologies, No. N-7113 or N-7413) 같은 cap analog를 별도로 준비해야 합니다. Enzyme을 사용하여 post- transcriptional capping을 한다면 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)과 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)을 준비해 주세요.

주의. Takara IVTpro™시리즈에는 capping system이 포함되어 있지 않습니다.

Q7. Takara IVTpro™ Kit에 modified NTP를 사용할 수 있나요?
Pseudo-UTP와 같은 modified NTP는 mRNA의 면역원성을 낮추기 위해 UTP 대신 사용되곤 합니다. Takara IVTpro™ Kit 역시 해당하는 NTP를 동량의 Modified NTP로 변경하여 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 사용자 매뉴얼을 참고해 주세요.

Q8. 이 제품으로 RNA를 합성 후 정제할 때 추천하는 제품이 있나요?
Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)에 포함된 LiCl solution으로 RNA를 정제할 수 있습니다. 다만 RNA의 크기가 300bp 이하이거나 농도가 0.1 ㎍/㎕ 이하인 경우 NucleoSpin RNA Clean-up (MN, No. 740948.10/.50/.250)같은 spin column이나 traditional한 phenol chloroform extraction 후 ethanol precipitation을 진행하는 방법을 사용하는 것을 권장합니다.

Q9. 5’-cap 구조는 어떻게 추가하나요?
5’-cap 구조는 cap analog (CleanCap^®, ARCA, mCap 등)를 사용하는 co-transcriptional capping 또는 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)을 사용하는 post-transcriptional capping으로 추가할 수 있습니다. 이에 대한 자세한 내용은 Post-transcriptional capping tech note의 내용을 참고 부탁드립니다.

Co-transcriptional capping의 프로토콜은 Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System (Code 6141) 또는 Takara IVTpro™ T7 mRNA Synthesis Kit (Code 6144)의 사용자 매뉴얼에서 확인할 수 있습니다.

Post-transcriptional capping의 프로토콜은 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)의 사용자 매뉴얼에서 확인할 수 있습니다. 추가적으로 VCE(Vaccinia capping Enzyme)를 사용하는 경우 Cap-0를 Cap-1 구조로 변경하기 위해 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)를 같이 사용합니다.

Post-transcriptional capping (Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A), mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A))
Q1. Vaccinia Capping Enzyme (VCE)은 thermostable한가요?
Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)은 thermostable하지 않습니다.

Q2. Capping에는 어떤 RNA에 적용될 수 있나요?
Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)은 uncapped RNA의 5′-triphosphate 또는 5′-diphosphate RNA에 적용될 수 있습니다 (uncapped RNA -> m7G-capped RNA (cap-0 RNA)).

Q3. 5’-capping은 효율이 어떻게 되나요?
Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)의 capping efficiency는 100%에 임박할 것으로 예상됩니다. 상대적으로 긴 시간이 필요하지만 ARCA와 같은 traditional co-transcriptional capping 방법과 비교할 때 높은 capping efficiency가 장점입니다.

Q4. 2’-O-methylation은 어떤 RNA에 적용될 수 있나요?
2’-O-methylation으로 첫번째 nucleotide를 메틸화 하기 위해서는 m7G-capped 구조 (cap-0)가 필요합니다. ARCA를 사용하는 경우 추가되는 3'-O-methylated m7G-cap 또한 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)를 적용할 수 있습니다.

Q5. Uncapped RNA에 cap-1을 추가하려면 어떻게 해야하나요?
1-step method와 2-step method 두가지가 있습니다. 1-step에서는 단일 튜브에서 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)이 mRNA에 cap-0 구조를 추가하는 동시에 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)이 Cap-1 구조로 변경시킵니다. 반면 2-step에서는 이 두 enzyme 반응이 순차적으로 진행됩니다. 2 step method는 적어도 한번 이상의 RNA purification step이 반응 사이에 필요합니다. 더 자세한 내용은 Post-transcriptional capping tech note의 내용을 참고 부탁드립니다.

Q6. Post-transcriptional capping과 관련한 주의사항이 따로 있을까요?
전체 RNA의 크기가 200 bp 이하인 경우 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)의 incubation 시간을 기존 30분에서 1시간으로 늘리는 것을 권장합니다. 또한 Vaccinia Capping Enzyme (Code 2460A)과 mRNA Cap 2-O-Methyltransferase (Code 2470A)을 같이 사용하는 경우 incubation 시간을 기존 1시간에서 2시간으로 늘리는 것을 권장합니다.