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shRNA 발현용 Retrovirus vectors

pSINsi vector 시리즈

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제조사 제품코드 제품명 용량 가격
(부가세별도)		 비고 사용자매뉴얼
Takara
 3660
 pSINsi-hH1 DNA
관련학술 구매하기 		20 μg
 408,000원  3660_DS.v0802Da.pdf
Takara
 3661
 pSINsi-hU6 DNA
관련학술 구매하기 		20 μg
 408,000원  3661_DS.v0802Da.pdf
Takara
 3662
 pSINsi-mU6 DNA
관련학술 구매하기 		20 μg
 408,000원  3662_DS.v0802Da.pdf

제품 설명
pSINsi 벡터 시리즈는 self-inactivated retro viral vector plasmid를 기본 골격으로 하여 RNA polymerase III (pol III) 계의 promoter에 의해 hairpin형 RNA를 발현시키는 vector이다. pol III 계열의 promoter 하류의 cloning site 에 hairpin형 RNA를 발현시키기 위하여 합성 올리고 DNA 배열을 삽입하는 것으로 siRNA 발현 retroviral vector plasmid를 얻을 수 있다. 선택 마커로 neomycine 내성 유전자를 가지고 있다. SiRNA 발현 retroviral vector로부터 Retrovirus Packaging Kit Eco/Ampho (Code 6160, 6161)를 이용하여 재조합 retrovirus를 조제할 수 있다.
원리
pSINsi vector 시리즈의 retroviral vector plasmid는 3'LTR U3영역의 promoter 활성이 결손되어 있어 역전사 후 염색체에 삽입한 프로바이러스 상태에서는 5’LTR의 promoter 활성이 소실되어 프로바이러스 유래의 mRNA는 전사되지 않게 되므로 polIII계의 promoter로부터 hairpin형 RNA와 SV40 promoter의 neomycin 내성 유전자만 전사된다. (아래 그림 참조)


hairpin형 RNA 발현 벡터
헤어핀 형 RNA를 발현시키기 위한 DNA 합성
Hairpin형 RNA를 발현시키기 위해서 Ligation의 제한 효소 사이트 + 표적 서열(sence) + 루프 서열 + 표적 서열 (antisence) + 터미네이터 서열 + Ligation의 제한 효소 사이트를 차례로 디자인한 합성 DNA 를 promoter의 하류에 삽입한다. pBAsi vector cloning site는 neomycin 내성 및 puromycin 내성의 경우 상류 측은 BamH I, 하류 측은 Xba I, Sse8387 I, Hind III 중 하나를 사용할 수 있다. 약제 내성 유전자를 포함하지 않는 pBAsi 벡터의 경우 위의 사이트뿐만 아니라 하류 Sal I, Acc I, Hinc II, Pst I, Sph I 사용 할 수 있다.
pol III 계 promoter의 전사 개시 점에서 표적 배열이 G 또는 A로 시작하지 않는 경우 표적 배열 앞에 G 또는 A를 삽입한다.
루프 배열의 예로는 CTGTGAAGCCACAGATGGG (Boden et al. 참고 문헌 1)이 보고되었고 GTGTGCTGTCC (Miyagishi et al. 참고 문헌 2)도 유용하다는 것이 확인되었다. 또한, 이외의 hairpin 루프로 Lee et al (참고 문헌 3) Paddison et al (참고 문헌 4), Paul et al. (참고 자료 5), Sui et al (참고 문헌 6)들에 의해 각각 다른 서열이 보고 되고 있다.
터미네이터 배열은 TTTTTT 배열을 가진다. (T가 4 개 계속되면 pol III 계 모터에 의한 전사가 멈춘다). siRNA 서열 사용시 hairpin 루프 배열 조합은 T가 4 개 이상 지속될 가능성이 있기 때문에 합성 DNA를 디자인 후 반드시 Top strand에 T가 4 개 이상 계속되지 않았는지 확인하는 것이 필요하다.

　　　　전사시작점*

BamH↓ 　　I

target sequence (sense)

Hairpin loop

target sequence (antisense)

Terminator

Cla I

Top strand

5'-GATCC(G/A)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

CTGTGAAGCCACAGATGGG

NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

(C/T)

TTTTTT

AT-3'

Bottom strand

3'-G(C/T)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

GACACTTCGGTGTCTACCC

NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

(G/A)

AAAAAA

TAGC-5'
보존
-20℃
Vectormap
pSINsi 벡터 시리즈는 3가지 다른 종류의 프로모터 플라스미드 벡터가 있다.

pSINsi - hH1 DNA : human H1 promoter (Accession S68670) 포함.
pSINsi - hU6 DNA : human U6 promoter (Accession X07425) 포함.
pSINsi - mU6 DNA : mouse U6 promoter (Accession X06980) 포함.

pSINsi 벡터의 제한 효소지도
각 벡터의 DNA 시퀀스 데이터
pSINsi-hH1 DNA sequence data
DNA sequence data
DNA sequence data
【주의】 시퀀스에서 1259 위치 (프로모터 상류, Hind III와 EcoR I 사이) Cla I 사이트가 있지만 일반 dam + 대장균에서 조제한 플라스미드는 dam methylase의 영향을 받기 때문에 1259 위치 의 Cla I 사이트는 절단되지 않습니다.

Keyword :
siRNA 발현 · 분석
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shRNA 발현용 Retrovirus vectors
pSINsi vector 시리즈
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투여한 합성 siRNA의 측정에
Synthetic siRNA Quantitation Kit